申请公本开了同一种时分离测定三种AGs的含量(妥布霉素、依替米星、奈替米星)的方法，该方法已成功分离了三种抗生素的混合物，同时应用于妥布霉素滴眼液、硫酸依替米星注射液和硫酸奈替米星注射液中AGs含量的测定，采用HPLC‑RRS联用技术测定AGs。实验中所用色谱柱为Agilent Zorbox SB‑C18 column(250mm×4.6mm i.d.，5μm)及保护柱(Security Guard C18，4×2mm，Phenomenex)。流动相为甲醇∶水(含0.2％TFA)＝5∶95(v/v)，HPLC流速为0.50mL·min‑1，λex＝λem＝362nm，柱温为30℃，进样量为20μL。探针为2.0×10‑5mol·L‑1的PSB溶液，pH为9.5，单泵的流速为0.2mL·min‑1，反应管长250cm，内径0.5mm。本申请建立了以RRS为检测方法建立的一种全新的HPLC检测模式，并成功用于不同制剂中AGs含量的测定中。拓宽了RRS技术的应用范围，并为HPLC提供了全新的检测模式。
【技术实现步骤摘要】
本申请属于药物分析
，具体地说，涉及同时分离测定三种AGs(妥布霉素、依替米星、奈替米星)的含量的方法。
技术介绍
氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics，AGs)是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，包括链霉素、庆大霉素、新霉素、妥布霉素，以及一些新合成氨基糖苷类药物如依替米星和奈替米星等。由于其廉价、毒性低及抗菌谱广的特点，AGs成为临床上使用最为广泛的抗生素。同时，AGs具有一定的耳毒性及肾毒性，为保证用药安全，剂量使用范围较窄，临床监管十分严格。由于AGs缺乏特征紫外吸收基团，目前其主要的分析方法包括微生物法，紫外可见光谱法，HPLC-柱前衍生法，HPLC-蒸发光散射检测法，HPLC-脉冲电化学检测方法，质谱法，HPLC-电喷雾串联质谱分析，毛细管电泳法和荧光偏振免疫法。目前，HPLC-衍生法和分光光度法是测定AGs的主要方法。然而，HPLC-衍生法仍有许多缺点无法避免，例如衍生化反应不完全、衍生试剂的额外费用等。此外，分光光度法的灵敏度不够高，不能满足痕量分析的临床要求。因此，建立一种简便，快速，灵敏度高的测定AGs的方法无论在制剂分析还是临床检测中都是十分必要的。目前，HPLC-RRS联用测定AGs的文献还未见报道。本文以RRS技术作为HPLC一种新型的检测模式，同时分离测定三种AGs的含量(妥布霉素、依替米星、奈替米星)，该方法已成功分离了三种抗生素的混合物，同时应用于妥布霉素滴眼液、硫酸依替米星注射液和硫酸奈替米星注射液中AGs含量的测定中。共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)是指当瑞利散射位于或接近分子吸收带时，电子吸收电磁波的频率与散射光频率相同，电子因共振而强烈吸收辐射能量并再次发生散射的过程。RRS因其灵敏度高、线性范围较宽、方法简便等优点，已发展成为光谱分析中活跃的研究领域。国内西南大学和北京大学先后在共振光的研究方面进行了开创性的工作。西南大学的刘绍璞等研究发现，静电作用、疏水作用以及电荷转移作用对于光谱特征以及RRS强度的增加有重要影响。通过离子缔合反应，RRS技术不仅可用于测定生物大分子 如蛋白质、核酸等还可应用于痕量离子及药物小分子的测定中，极大的拓展了RRS的应用领域。近年来，RRS与流动注射分析及毛细管电泳联用方法的成功建立，表明被测物可在动态反应中与探针结合成离子缔合物，并被定量检测。尽管这些联用方法仍存在着一定的不足，却充分发挥了RRS高灵敏度及高选择性的优点同时避免了其重现性、稳定性较差的不足。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)自20世纪70年代建立以来，以高速、高效、灵敏度高及检测范围广等特点成为目前应用最多的色谱分析方法，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。经过几十年的发展，HPLC已与众多检测技术相结合，从传统的紫外、荧光检测器到先进的质谱及核磁共振检测技术，HPLC已可同时满足对被测物定量及定性的分析需求。HPLC与更为精密的检测仪器联用的同时也大大提高了设备成本及检测成本，因此发展高效通用的检测器仍是HPLC的主要发展趋势之一。虽然高效液相色谱法(HPLC)是目前药物分析中最常用的检测方法，但HPLC与RRS联用(HPLC-RRS)的方法鲜见报道。RRS技术与其他分析仪器联用方法的成功建立表明其可以作为一种新型的检测方法与HPLC联用(HPLC-RRS)。RRS技术作为一种新型的HPLC检测方法，其突出优点是RRS信号的产生不依赖于被测物本身的化学特性，尤其适用于无紫外特征吸收及非荧光物质的检测。
技术实现思路
有鉴于此，本申请要解决HPLC-衍生法衍生化反应不完全、衍生试剂的额外费用高，分光光度法的灵敏度不够高，不能满足痕量分析的临床要求的问题。提供一种简便，快速，灵敏度高的测定AGs的方法，无论在制剂分析还是临床检测中都是十分必要的。为了解决上述技术问题，本申请公开了一种同时分离测定三种AGs的含量的方法，采用高效液相色谱与共振瑞利散射联用技术，先用高效液相色谱法将供试品中的AGs洗脱分离，再将洗脱分离后的妥布霉素、依替米星、奈替米星和探针溶液混合反应，最后将混合反应后的反应液注入检测器进行检测；进一步的，所述高效液相色谱的色谱条件为：甲醇∶水(含0.2％TFA)＝5∶95(v/v)为流动相，流速＝0.50mL·min-1，所述探针溶液为PSB溶液，所述检测器为荧光检测器。进一步的，所述检测波长λex＝λem＝362nm。进一步的，所述PSB溶液浓度为2.0×10-4mol·L-1。进一步的，所述BR缓冲液溶液pH＝9.5。进一步的，所述BR缓冲液的流速为0.2mL·min-1。进一步的，所述反应管管长250cm，内径0.5mm。进一步的，所述三种AGs的最低检测限为1.0μg·mL-1。进一步的，所述三种AGs的线性范围为2.0μg·mL-1～20.0μg·mL-1。进一步的，所述色谱条件的色谱柱为C18，5μm，250mm×4.6mm。与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：1)本申请的技术方案，建立了HPLC-RRS联用同时分离测定三种AGs的含量。2)本申请的检测方法，方法简便、快速、灵敏度高、选择性好并成功用于分离了三种抗生素的混合物，同时应用于妥布霉素滴眼液、硫酸依替米星注射液和硫酸奈替米星注射液中AGs含量的测定中。3)本申请的HPLC-RRS联用方法，进一步拓宽了RRS技术的应用范围，并为HPLC提供了一种全新的检测模式。当然，实施本申请的任一产品不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为本申请实施例中三种氨基糖苷类抗生素及PSB的RRS光谱图；图2为本申请实施例中PSB-TOB体系RRS光谱图；图3为本申请实施例中酸度对RRS反应的影响图；图4为本申请实施例中SB-TOB离子缔合物UV/VIS吸收图与RRS光谱图对比图；图5为本申请实施例中TOB与PSB反应式图；图6为本申请实施例中PSB-AGs体系HPLC-RRS色谱图；图7为本申请实施例中PSB浓度对RRS反应的影响图；图8为本申请实施例中探针流速对RRS反应的影响图；图9为本申请实施例中反应管长度对RRS反应的影响图。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1、试剂妥布霉素(Tobramycin，TOB)、依替米星(etimicin，ETI)及奈替米星(netilmicin，NET)标准品均购自中国药品生物制品检定所，滂胺天蓝(PSB)购自Chroma公司(德国)。甲醇和乙腈均为色谱纯(江苏省汉邦公司)。BR缓冲溶液由0.04mol·mL-1H3PO4、H3BO3、CH3COOH与0.02mol·mL-1NaOH溶液按一定比例混合，配成不同pH值的缓冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
以RRS技术作为HPLC一种新型的检测模式，同时分离测定三种AGs的含量(妥布霉素、依替米星、奈替米星)，成功分离了三种抗生素的混合物，同时应用于妥布霉素滴眼液、硫酸依替米星注射液和硫酸奈替米星注射液中AGs含量的测定中。所述HPLC‑RRS的色谱条件为：流动相为甲醇∶水(含0.2％TFA)＝5∶95(v/v)，流速为0.50mL·min‑1，所述探针溶液为磷酸盐缓冲液，所述检测器为荧光检测器。
【技术特征摘要】
1.以RRS技术作为HPLC一种新型的检测模式，同时分离测定三种AGs的含量(妥布霉素、依替米星、奈替米星)，成功分离了三种抗生素的混合物，同时应用于妥布霉素滴眼液、硫酸依替米星注射液和硫酸奈替米星注射液中AGs含量的测定中。所述HPLC-RRS的色谱条件为：流动相为甲醇∶水(含0.2％TFA)＝5∶95(v/v)，流速为0.50mL·min-1，所述探针溶液为磷酸盐缓冲液，所述检测器为荧光检测器。2.如权利要求1所述的同时分离测定三种AGs的含量的方法，其特征在于，所述检测波长λex＝λem＝362nm。3.如权利要求1所述的同时分离测定三种AGs的含量的方法，其特征在于，所述PSB探针溶液浓度为2.0×10-5mol·L-1。4.如权利要求1所述的同时分离测定三种AGs的含量的方法，其特征在于，所述BR缓冲液溶液pH＝9.5。5.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：尚京川，王靖雯，文瑶，贾春燕，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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