本发明专利技术公开了一系列新型氨基糖苷类化合物的制备与应用及其高产工程菌的构建方法，属于生物医药领域。这些新型氨基糖苷类化合物包括：GK-A、GK-X2、GK-418、GK-JI-20B、GK-JI-20A、GK-C1、GK-C1a、GK-C2a、GK-C2、GK-C2b。失活或缺失genM2基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌能够产生这些化合物，在该菌株的基础上进一步失活或缺失相关基因能够使GK-A、GK-X2、GK-418、GK-JI-20B、GK-C1a、GK-C2b等的产量大幅度提高。本发明专利技术的新型氨基糖苷类化合物具有良好的抗菌效果，为抗生素耐药性问题提供了新的解决手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一系列新型氨基糖苷类化合物的制备与应用及其高产工程菌的构建方法。
技术介绍
伴随着细菌多重耐药性以及“超级细菌”的出现，理性设计具有新活性的氨基糖苷类抗生素俨然成为人们关注的焦点，而利用合成生物学和代谢工程的方法，是一种比化学合成和化学半合成更为有效、经济和环境友好的手段。前人对氨基糖苷类抗生素生物合成机制、分子水平的作用机制及耐药机制的全面深入揭示为我们利用合成生物学与代谢工程的思路对天然氨基糖苷类抗生素进行改造与创新提供了重要的基础和前提。天然氨基糖苷类抗生素的结构中存在着两类重要及独特的天然结构单元：来自于丁酰苷菌素的AHBA侧链基团与来自于庆大霉素的多个修饰基团。前人在利用氨基糖苷类抗生素天然结构单元进行结构改造时，由于通过化学手段来利用庆大霉素修饰基团进行氨基糖苷类抗生素结构改造时需要克服更为复杂及困难的化学立体选择性问题，因而研究者们大多利用了AHBA侧链基团。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一系列基于庆大霉素(Gentamicin)与卡那霉素(Kanamycin)结构改造的新型氨基糖苷类化合物Genkamicins(Gentamicin与Kanamycin的组合)。本专利技术的目的另一目的在于提供产生这些新型氨基糖苷类化合物的菌株。本专利技术的目的再一目的在于提供产生这些新型氨基糖苷类化合物的制备方法。本专利技术的目的还在于提供这些新型氨基糖苷类化合物的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供的新型氨基糖苷类化合物包括：GK-A、GK-X2、GK-418、GK-JI-20B、GK-JI-20A、GK-C1、GK-C1a、GK-C2a、GK-C2、GK-C2b，其结构式如下：一种产生上述新型氨基糖苷类化合物的工程菌株，为失活或缺失genM2基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。一种高产GK-A的工程菌株，为同时失活或缺失genM2、genD1、genK基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。一种高产GK-X2的工程菌株，为同时失活或缺失genM2、genQ、genK基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。一种高产GK-418的工程菌株，为同时失活或缺失genM2、genQ基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。一种高产GK-JI-20B的工程菌株，为同时失活或缺失genM2、genB3基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。一种高产GK-C1a、GK-C2b和/或X2的工程菌株，为同时失活或缺失genM2、genK基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。所述的庆大霉素产生菌优选为棘孢小单孢菌ATCC15835。所述的kanE基因优选来源于卡那霉素链霉菌ATCC12853。上述工程菌株的构建方法，包括如下步骤：将含有kanE基因的质粒导入相应基因失活或缺失的庆大霉素产生菌中构建得到；所述的含有kanE基因的质粒导入庆大霉素产生菌中能够表达kanE基因。上述新型氨基糖苷类化合物的提取方法，包括如下步骤：将上述任一项工程菌株发酵培养，发酵液用硫酸酸化后离心，收集上清液；上清液通过阳离子交换树脂进行吸附，吸附后用氨水进行洗脱，洗脱液挥发氨气完全后再通过阴离子交换树脂吸附，收集洗脱液即得发酵液提取产物，发酵液提取产物中含有新型氨基糖苷类化合物。上述新型氨基糖苷类化合物的纯化方法，包括如下步骤：(1)液相色谱与蒸发光散射检测仪联用(HPLC-ELSD)从发酵液提取产物中纯化氨基糖苷类化合物将提取后的发酵产物溶于Milli-Q水中后过水系滤膜，过滤后取溶液进样，色谱条件为：A相为含0.2％(v/v)三氟乙酸的水溶液(即100mL溶液中含有三氟乙酸0.2mL)，用氨水调节pH值至2.0；B相为乙腈；流速4mL/min，洗脱程序为2％-8％(体积百分数)B相梯度洗脱20min，柱后分流比为1:3，以1mL流速进入蒸发光散射检测器；检测器雾化池温度设置为105℃，漂移管温度设置为105℃，气体流速为2.8L/min。(2)纯化后产物硫酸盐的制备将HPLC-ELSD制备的三氟乙酸盐形式产物冻干，除去游离三氟乙酸后溶于Milli-Q水，每10mg产物以4mL阴离子树脂除去三氟乙酸根离子，再以浓硫酸将溶液pH调至5.5-5.8后冻干得硫酸盐形式氨基糖苷类化合物。上述新型氨基糖苷类化合物在抗菌中的应用。上述新型氨基糖苷类化合物在制备抗菌药物中的应用。本专利技术的新型氨基糖苷类化合物具有良好的抗菌效果，GK-C1a和GK-C1的抗菌活性比卡那霉素有明显地提高，GK-C1a和GK-C1对于原本对卡那霉素不敏感的铜绿假单孢杆菌以及原本对卡那霉素及庆大霉素均不敏感的鲍曼不动杆菌都表现出很强的抗菌活性。本专利技术为抗生素耐药性问题提供了新的解决手段。附图说明图1是新型氨基糖苷类化合物Genkamicins生物合成示意图。图2是微量肉汤稀释法药物抗菌敏感性试验方法的示意图。图3是pWHU47质粒图谱。图4是突变株ΔgenM2PCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU47、ATCC15835、ΔgenM2、ΔgenM2。图5是突变株ΔgenM2的LC-ESI-HRMS检测结果图，A：庆大霉素野生型(WT)产生菌ATCC15835，B：突变株ΔgenM2。图6是pWHU155质粒图谱。图7是突变株ΔgenM2::kanE的PCR验证结果图，其中，泳道1-3分别是1KbLadder、pWHU155、ΔgenM2::kanE。图8是突变株ΔgenM2::kanE的LC-ESI-HRMS检测结果图，A：庆大霉素野生型产生菌ATCC15835，B：突变株ΔgenM2::kanE。图9是突变株ΔgenS2ΔgenKΔgenM2PCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU47、ATCC15835、ΔgenS2ΔgenK、ΔgenS2ΔgenKΔgenM2。图10是各突变株异源回补kanE的PCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU155、ΔgenS2ΔgenKΔgenM2::kanE、ΔgenQΔgenKΔgenM2::kanE、ΔgenD1ΔgenKΔgenM2::kanE。图11是pWHU2649质粒图谱。图12是突变株ΔgenD1ΔgenKΔgenM2PCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU47、ATCC15835、ΔgenD1ΔgenKΔgenM2、ΔgenD1ΔgenK。图13是突变株ΔgenQΔgenKΔgenM2PCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU47、ATCC15835、ΔgenQΔgenK、ΔgenQΔgenKΔgenM2。图14是突变株ΔgenM2ΔgenQ::kanEPCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU47、ATCC15835、ΔgenM2::kanE、ΔgenM2ΔgenQ::kanE。图15是突变株ΔgenM2ΔgenB3::kanEPCR验证结果图，其中，泳道1-5分别是1KbLadder、pWHU47、ATCC15835、ΔgenM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一系列新型氨基糖苷类化合物，其特征在于包括：GK‑A、GK‑X2、GK‑418、GK‑JI‑20B、GK‑JI‑20A、GK‑C1、GK‑C1a、GK‑C2a、GK‑C2、GK‑C2b，其结构式如下：
【技术特征摘要】
1.一系列新型氨基糖苷类化合物，其特征在于包括：GK-A、GK-X2、GK-418、GK-JI-20B、GK-JI-20A、GK-C1、GK-C1a、GK-C2a、GK-C2、GK-C2b，其结构式如下：2.产生权利要求1所述的新型氨基糖苷类化合物的工程菌株，其特征在于：为失活或缺失genM2基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。3.一种高产权利要求1中所述的GK-A、GK-X2、GK-418或GK-JI-20B的工程菌株，其特征在于：高产GK-A的工程菌株为同时失活或缺失genM2、genD1、genK基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌；高产GK-X2的工程菌株为同时失活或缺失genM2、genQ、genK基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌；高产GK-418的工程菌株为同时失活或缺失genM2、genQ基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌；高产GK-JI-20B的工程菌株为同时失活或缺失genM2、genB3基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。4.一种高产权利要求1中所述的GK-C1a、GK-C2b和/或X2的工程菌株，其特征在于：为同时失活或缺失genM2、genK基因且能异源表达kanE基因的庆大霉素产生菌。5.根据权利要求2-4任一项所述的工程菌株，其特征在于：所述的庆大霉素产生菌为棘
\t孢小单孢菌ATCC15835。6.根据权利要求2-4任一项所述的工程菌株，其特征在于：所述的kanE基因来源于卡那霉素链霉菌ATCC12853。7.权利要求2-4任一项所述的工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙宇辉，简心韵，邓子新，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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