本发明专利技术公开了一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，依次包括补料分批发酵、低温离心、硫酸铵分级沉淀、低温离心、取沉淀溶解，再进行透析、冷冻干燥。本发明专利技术从凝结芽孢杆菌发酵液中提取蛋白质的方法，建立了一种简单的操作流程，得到不同分子量的蛋白质和多肽。通过对提取出的蛋白质进行抑菌作用测定，发现部分组分蛋白质具有一定的抑制病原菌作用。此方法不仅工艺简单、提取率高，而且提高了不同分子量蛋白质的得率，为新型微生态制剂的生产提供模板。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，具体是将凝结芽孢杆菌进行分批补料培养后得到的发酵液，经过低温离心、硫酸铵分级沉淀、低温离心、取沉淀，用缓冲溶液溶解，再进行透析、冷冻干燥，提取出凝结芽孢杆菌发酵液中的蛋白质，属于发酵工程
技术背景凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)，是革兰染色阳性菌，菌体呈杆形，单个或成短链，有运动性。其主要特征与普通乳酸菌十分相似，因抑菌效果突出而迅速发展成为国际市场上新一代益生菌保健产品。凝结芽胞杆菌是极温和的益生菌，并未有不良反应报道，是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的乳酸菌(1992年美国FDA公布了5种芽胞杆菌为可以用作饲料的安全菌株，凝结芽胞杆菌名列第一位)。用于微生态制剂的枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌虽名为减毒或无毒菌株，但安全性仍不如凝结芽胞杆菌。凝结芽胞杆菌不但本身可以被制作成微生物菌剂和微生物肥料，其产生的生理活性物质也是种类丰富，如细菌素、酶类、激素等。因此，凝结芽胞杆菌是目前最具市场潜力的一种芽胞杆菌，国内外多把凝结芽胞杆菌作为重要的微农用微生态制剂出发菌，广泛应用于食品、医药、农业等领域。代谢产物是靠菌种来完成的。菌种越多，并且处于最佳生产状态，产量就会越大。菌体发酵液中成分复杂，在如此复杂的体系中，抑菌物质的分离纯化要根据研究工作的类型而定。常规的蛋白质分离技术对于抗菌蛋白的提取是可行的，但是作为性质特异的物质如脂类等，结构性质差异大，分子量一般较小，某些常规的蛋白层析、电泳技术并不适合需要进一步改进，因此给抗菌蛋白的分离纯化工作带来极大阻碍。与陶黎明等人用有机溶剂沉淀分离提取蛋白质的方法相比较，本专利技术中利用硫酸铵分级沉淀的方法分离出蛋白质，显著降低有机溶剂对蛋白质结构破坏，避免抑菌蛋白质失活，不需要低温下提取，简化操作流程。
技术实现思路
本专利技术针对当前凝结芽孢杆菌制剂普遍存在货架期期短的难题，提供了一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，此方法不仅工艺简单、提取率高，而且提高了不同分子量蛋白质的得率，为新型微生态制剂的生产提供模板。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：(1)补料分批发酵：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18～22％，温度控制在35～42℃，摇床转速140～200r/min，培养32～48h后，得到种子液。再移取发酵培养基体积分数比为4～8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％，控制温度在36～42℃，通入无菌空气，通气量保持在3～6L/(L·min)，搅拌速率140～200r/min，pH值为6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～100g/L，培养32～48h后即为发酵液；(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3～9℃低温离心机中离心得到上清液和沉淀，取上清液；(3)硫酸铵分级沉淀：将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20～24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20～26％，磁力充分搅拌3～4h后，低温离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，并以硫酸铵饱和度15～21％为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物；重复上述步骤，收集第三组分的沉淀物；(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二和三级沉淀物装好并悬于含20～30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～15mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的35～45％，在温度为5～10℃条件下，用蒸馏水透析6～10h，期间换液2～4次；再转至缓冲液中，相同温度条件下继续透析28～32h，得蛋白提取液；将提取液冷冻干燥即得到蛋白质。其中凝结芽胞杆菌菌种的拉丁学名是：Bacilluscoagulans，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.6681。优选步骤(1)中种子液培养基的组分为：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl4～8g/L，pH为6.5～7.5。优选步骤(1)中发酵培养基的组分为：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl4～8g/L，CaCO310～15g/L,K2HPO40.8～1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1～0.6g/L，ZnSO4·7H2O0.005～0.015g/L，MnCl2·4H2O0.001～0.005g/L，pH为6.5～7.5。优选步骤(2)中低温离心转速在8000～10000r/min，离心5～9min。优选步骤(3)低温离心温度在3～9℃，转速为10000～12000r/min，离心15～19min。优选步骤(4)缓冲液成分：7～9mmol/LTris-HCl、0.1～0.25mol/LNaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸。抑菌活性的检测：采取上述方法提取的第一、二、三级蛋白质沉淀物透析冷冻干燥后的物质，各称取4～8μg溶于无菌蒸馏水中，制备出浓度4～8μg/mL的溶液。中心接有棉花黄萎病病菌菌碟的PDA平板培养48～52h后，于上下左右距离培养皿边缘2～3cm处用打孔器(d＝6mm)各打一个孔，在其中三个孔注入10～8μL溶解后的第一、二、三级蛋白质沉淀物，另一个空孔以无菌蒸馏水为对照。温度在26～32℃培养48～52h，观察发现第二、三级蛋白质组分具有显著的抑菌效果。CGMCCNo.6681菌株具有下述性质：1、形态与培养特征：该菌为革兰氏染色阳性菌，菌体呈杆形，(0.8～1)μm×(3～4)μm，单个或成短链。产生卵圆形芽孢，大多偏菌体一端菌，有的孢子囊膨胀，有运动性。对外界环境抵抗力很强，90℃处理10min，100℃处理5min不会失活，pH值为4.0～9.0时也能生长。在营养琼脂培养基上边缘不整齐，呈扁平圆形白色菌落，2～3mm大小。兼性厌氧菌，生长温度为20～55℃，最适生长温度为35～45℃。2、生理生化特性凝结芽孢杆菌CGMCCNo.6681菌株的主要生理生化特征见表1：表1菌株的生理生化特征注：+：阳性或生长；－：阴性或不生长有益效果：本专利技术提供了一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法。该方法制得菌悬液在植物的体表定殖能力增强，集促生、抑菌和杀虫于一体，其多种功效决定了其推广具有非常大的前景，符合现代农业的要求。保藏信息上述凝结芽孢杆菌其分类命名为Bacilluscoagulans，参据的微生物(株)为：NJYHHWG877005，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为CGMCC，保藏日期是2012年10月18日，登记入册的编号是CGMCCNo.6681。具体实施方式以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：(1)补料分批发酵：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18～22％，温度控制在35～42℃，摇床转速140～200r/min，培养32～48h后，得到种子液；再移取发酵培养基体积分数比为4～8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％，控制温度在36～42℃，通入无菌空气，通气量保持在3～6L/(L·min)，搅拌速率140～200r/min，pH值为6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～100g/L，培养32～48h后即为发酵液；(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3～9℃低温离心机中离心得到上清液和沉淀，取上清液；(3)硫酸铵分级沉淀：将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20～24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20～26％，磁力充分搅拌3～4h后，低温离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，并以硫酸铵饱和度15～21％为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物；重复上述步骤，收集第三级沉淀物；(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二和三级沉淀物装好并悬于含20～30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～15mg/mL；将悬液移至透析袋中，排出空气并密封，透析袋中悬液的装液量为透析袋体积的35～45％，在温度为5～10℃条件下，用蒸馏水透析6～10h，期间换液2～4次；再转至缓冲液中，相同温度条件下继续透析28～32h，得蛋白提取液；将提取液冷冻干燥即得到蛋白质。...
【技术特征摘要】
1.一种从凝结芽孢杆菌补料分批发酵液中提取蛋白质的方法，其具体步骤如下：(1)补料分批发酵：将凝结芽孢杆菌菌株接种在营养琼脂培养基后培养，选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，锥形瓶装液量为锥形瓶体积的18～22％，温度控制在35～42℃，摇床转速140～200r/min，培养32～48h后，得到种子液；再移取发酵培养基体积分数比为4～8％的种子液接入发酵罐中发酵培养，其中发酵罐装液量为发酵罐体积的25～45％，控制温度在36～42℃，通入无菌空气，通气量保持在3～6L/(L·min)，搅拌速率140～200r/min，pH值为6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～100g/L，培养32～48h后即为发酵液；(2)低温离心：将步骤(1)中的发酵液装入离心管中，置于3～9℃低温离心机中离心得到上清液和沉淀，取上清液；(3)硫酸铵分级沉淀：将步骤(2)中的得到的上清液置于搅拌仪上，在20～24℃温度下加入固体硫酸铵，使其饱和度达相应温度下的20～26％，磁力充分搅拌3～4h后，低温离心收集第一级沉淀物和第一级上清液；将得到的第一级上清液转入烧杯中，并以硫酸铵饱和度15～21％为梯度，继续加入固体硫酸铵充分搅拌，即离心收集到蛋白组分的第二级沉淀物；重复上述步骤，收集第三级沉淀物；(4)透析：将步骤(3)中得到的第一、二和三级沉淀物装好并悬于含20～30％体积分数Tris碱的蒸馏水中，使悬液中沉淀物的浓度达到5～15mg/m...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡永红，杨文革，丁志雯，马小平，钱永根，章泳，沈飞，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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