本发明专利技术公开了一种从动物细胞规模培养物中高效快速纯化制备片段抗体的方法，采用扩张柱床吸附、阴离子层析浓缩、疏水层析纯化方法，扩张柱床阳离子层析吸附大规模细胞培养物中的抗体ＩｇＧ，通过改变缓冲系统ｐＨ值进行洗脱；收集的洗脱峰即可直接进行阴离子层析；被充分浓缩纯化的抗体ＩｇＧ，直接被胃蛋白酶酶切获取片段抗体，进行疏水层析纯化，最终获取的片段抗体纯度不小于９７％，整个纯化过程在１２小时内即可完成。纯化工艺的衔接采用同一缓冲系统，通过改变ｐＨ值的方法进行洗脱，省去了缓冲系统更换步骤，使前后纯化过程衔接紧密；通过阳离子－阴离子色谱结合的浓缩方法替代传统的硫酸铵沉淀浓缩方法。具有高效、快速、成本低、纯度高、稳定、批次间结果差异小等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
的蛋白质纯化技术，主要涉及抗体类包括单克隆抗体和小分子片段抗体，人源化或人-鼠嵌合抗体以及片段抗体的纯化制备工艺。特别涉及，适用于治疗用抗体类药物的生产制备。
技术介绍
抗体治疗已成为当今生物治疗肿瘤、流行性和感染性疾病的重要手段。至2004年2月，美国FDA已批准16个抗体治疗药物上市，市场销售额已超过2×109美金。抗体类药物以其高度的特异性、有效性和安全性成为国际药品市场上一大类新型治疗剂。在16个抗体治疗药物中，12个均为人源化或人鼠嵌合抗体(美国FDA网页http//www.fda.gov)。放射免疫治疗是(Radioimmuno-therapy，RIT)以抗体为载体，将携带的放射性核素借助于抗体的导向作用集中浓聚，从而提高对肿瘤细胞杀伤作用，减少正常组织损伤，在16个抗体治疗药物中有Y90和I131两种放射性核素标记的鼠原性抗体(90Y-IbritumomabIDEC 2002；Tositumomab and Iodine I131Tositumomab Corixa 2003)用于肿瘤导向治疗。F(ab’)2片段抗体和Fab小分子抗体，比较鼠源性全抗具有免疫原性低，肿瘤穿透能力较强，肿瘤部位滞留时间较长等特点。因此更适合作为肿瘤放射免疫治疗的靶向载体。动物细胞大规模培养生产蛋白治疗药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多抗体指征性的治疗，抗体需用较高剂量或延缓性长期用药。因此，经济型的过程放大是工艺评价的重要指标。扩张柱床吸附技术可将大规模培养的回收液直接上柱，一步完成吸附、浓缩和纯化，减少工艺步骤、节省资金投入和增加产品收率，被生物制药工业领域广泛接受。Protein A亲和色谱扩张柱床吸附在抗体制备工艺中是最常为采用操作方式，因为Protein A亲和色谱可选择性地有效结合哺乳动物的IgG分子，一步高效回收并纯化细胞产物混合物中的抗体，回收率大于99.5％，同时亲和层析还可有效的清除病毒；由于亲和层析操作步骤简单快速，在复杂的制造工艺中容易做到质量控制和产品的一致性。Protein A亲和色谱的不利因素主要是工艺成本高和合成树脂的稳定性。在抗体制备工艺中Protein A亲和色谱的总成本费用高于离子交换色谱的30％，加上色谱的再生和其它材料费用，成本上升到35％。此外，色谱配合体在极度的处理条件下可变形，脱落的Protein A分子对人体具有免疫原性并可引起生理反应。Genentech公司最为常用的工艺包括三步色谱法，Protein A亲和色谱—阳离子色谱—阴离子色谱。有关F(ab’)2片段抗体的酶切和纯化近年来报道不多。早期的方法是采用硫酸铵沉淀和热处理两者结合，这种方法既费时，成本又高，无法作为生产；亲合色谱Protein A和Protein G由于它们结合IgG的Fc端，不能用于F(ab’)2的纯化。Morimoto andInouye and Inouye and Morimoto用疏水色谱吸附纯化F(ab’)2片段抗体，在SDS-PAGE和胶过滤两种方法显示F(ab’)2在单色谱峰中有较高的均质性；Koichi Morimoto和Kuniyo Inouye用Tsk gel Phenyl-5PW疏水色谱吸附纯化IgGl型F(ab’)2片段抗体，其纯度达到98％，但其都在小规模实验阶段进行，尚未进入中试放大工艺生产。在治疗性抗体的纯化工艺中，除考虑到产品的纯度、回收率，还必需考虑的重要一点是工艺过程的质量控制，有效去除杂质包括来自宿主细胞的蛋白、DNA、抗体异构体、碎片，以及小分子和潜在的污染物如内毒素、滤过性病毒等。治疗性F(ab’)2片段抗体的纯化工艺比较全抗体，就其过程控制更为复杂，需考虑更多的过程衔接，产品得率，以及残留的酶量和小分子碎片的污染等。申请人在抗人肝癌F(ab’)2抗体制备工艺中，采用三步色谱纯化，第一步STREAMLINESP阳离子吸附层析获取杂交瘤细胞培养液中的IgG；第二步阴离子吸附浓缩，继而胃蛋白酶酶切IgG；第三步Phenyl-5PW疏水色谱纯化F(ab’)2片段抗体，同时去除细菌内毒素。整个工艺过程中，申请人就工艺过程的关键参数进行比较分析，如产品回收率与条件，工艺衔接与方法选择，终产品纯度与活性保持，以及工艺过程的放大，选择最佳参数标准，以获得高效、快速的F(ab’)2抗体纯化工艺。目前有关F(ab’)2片段抗体纯化制备工艺的专利有以下几篇米力，陈志南等中国专利技术专利ZL 99115730.3，名称为在单克隆抗体F(ab’)2和Fab片段的制备方法，其权利要求的描述为单克隆抗体腹水，用50％的饱和硫酸胺粗提二次，F(ab’)2制备用胃蛋白酶与IgG酶切比例为1∶100，37℃反应2-3h；Fab用木瓜蛋白酶，酶与IgG的比例1∶100，37℃反应1-2h；HPLC疏水液相色谱法纯化F(ab’)2、Fab片段抗体，用Phenyl Sepharose HighPerformance疏水填料(Pharmacia)分二次纯化一次纯化A液为1～1.4M硫酸胺0.05MpH5.0醋酸钠缓冲液，B液为0.05M pH5.0醋酸钠缓冲液；二次纯化A液用0.7～1.0M硫酸胺0.05M pH5.0醋酸钠缓冲液，B液为0.05M pH5.0醋酸钠缓冲液，线性梯度洗脱时间30-40分钟；纯化后立即冻干，加10％低分子右旋糖酣做复性剂。米力、李玲等中国专利技术专利(ZL 01131736.1)，名称为连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，其权利要求中有关抗体回收纯化的描述产物回收纯化，采用Streamline SP介质，一步回收培养上清中的抗体，DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，抗体成品冻干保存。抗体产物培养上清调解pH值4-7，电导值2-5mS/cm；平衡液(A液)pH4-7；洗脱液(B液)A液+1M NaCl。用DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质。在pH4～7的条件下，热源吸附于柱上，抗体在穿过峰中流出；再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的热源，柱子可重复使用。Ngo；That T.有关抗体纯化工艺(United States Patent，No4,933,435)，其权利要求主要描述用固定相proteinA、proteinG色谱结合吸附免疫球蛋白的纯化工艺，所用的缓冲系统的pH6-10，包含至少一种多羧基酸，浓度0.5-0.9M。Sullivan；John B，Russell；Findlay E.有关抗体纯化工艺(United States Patent，No 4,849,352)专利中，描述用多聚苯烯酰氨凝胶亲和色谱法分离木瓜蛋白酶切的Fab片段抗体和胃蛋白酶切的F(ab’)2抗体，对纯化工艺的条件和方法未作具体描述。Ngo；That T.用固定Protein A亲合色谱纯化单克隆抗体工艺专利(United StatesPatent，No 4,801,687)，工艺条件免疫球蛋白的吸附缓冲液pH7.5-10，缓冲液浓度0.6-1.75M，是单价的阳离子或多碱基的阴离子的缓冲系统。免疫球蛋白的解吸附缓冲液条件pH3-6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效快速纯化制备片段抗体的方法，采用扩张柱床吸附－阴离子层析浓缩－疏水层析纯化三步纯化，从细胞规模培养物中分离纯化抗体ＩｇＧ，酶切后纯化制备片段抗体，整个纯化工艺的衔接采用同一缓冲系统，通过改变ｐＨ值的方法进行洗脱，减少了工艺过程缓冲系统置换的步骤，其特征在于，包括以下步骤： （１）动物细胞规模培养物中分离纯化抗体ＩｇＧ，先用Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ阳离子层析吸附动物细胞规模培养物中的抗体ＩｇＧ，得到初步纯化的抗体ＩｇＧ，其过程参数为： ａ．Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ阳离子层析，动物细胞培养物无须澄清和浓缩，用超纯水稀释至电导率为４ｍｓ／ｍｌ～６ｍｓ／ｍｌ，吸附条件用缓冲系统（Ａ），直接上样； ｂ．解吸附条件用缓冲系统（Ｂ），直接洗脱，收集洗脱峰； （２）阴离子层析，抗体ＩｇＧ被充分浓缩纯化；胃蛋白酶酶切获取Ｆ（ａｂ’）↓［２］片段；其过程参数为： ａ．吸附条件用缓冲系统（Ｂ），阳离子层析洗脱峰直接上样；解吸附条件用缓冲系统（Ａ），收集洗脱峰，进一步浓缩纯化抗体ＩｇＧ； ｂ．酶切用缓冲系统（Ａ），酶与抗体１∶１００（ｇ／ｇ）混合，３７℃水浴反应０．５ｈ－２ｈ，调整ｐＨ＝６－８终止反应； （３）疏水层析纯化片段抗体，其过程参数为： ａ．吸附条件用缓冲系统（Ａ）加入０．８－１．５Ｍ硫酸铵，酶切后的样品同样处理后上样， ｂ．解吸附条件用缓冲系统（Ａ）梯度洗脱，收集洗脱峰。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：米力，唐浩，余晓玲，谢丽，
申请(专利权)人：陈志南，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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