本发明专利技术(第一方式)是一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，其特征在于，使用具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体1与具有阳离子交换基团的载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱；本发明专利技术(第二方式)是具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有pKa为4.0以上的含有羧基的配体的阳离子交换基团的载体，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术（第一方式)是将具有用于特异性纯化祀分子(例如，抗体或源自抗体的物 质。W下有时将它们总称为抗体等）的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体作为 整体来使用而对抗体等进行纯化的方法，本专利技术设及在一个色谱步骤中实施亲和色谱纯化 和阳离子交换色谱纯化的新抗体纯化方法及由该方法得到的抗体。 另外，本专利技术（第二方式)是使用了阳离子交换基团下也称为具有阳离子交换 基团的载体、阳离子交换载体)的抗体等(抗体或源自抗体的物质）的新纯化法，本专利技术设及 PH4.0W下的抗体等的纯化方法及由该方法得到的抗体，但作为W簇基为配体的阳离子交 换载体的使用抑，通常不会选择抑4.0W下。
技术介绍
作为W抗体为主药的抗体医药品的主要成分的单克隆抗体，主要使用哺乳类培养 细胞等W重组蛋白质的形式在培养液中表达，通过多步色谱、膜工序纯化至高纯度，然后进 行制剂。抗体医药品为免疫球蛋白G及其类似物，一般而言除了称为抗体的分子W外，还含 有由作为免疫球蛋白分子的恒定区的Fc区与其它功能性蛋白质或肤融合而成的Fc融合蛋 白质(含有化的分子）。而且还包含化b、scFv、W及双抗体(diabody)等低分子化抗体。另外， 运些抗体医药品还包含W微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药品、在菌体内 或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药品。 该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体(二聚体W上的多聚体)成 为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的重要课题。在此，所谓单体， 例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体具 有下述构成：由作为恒定区的Fc区和可变区构成的重链化链)2分子W及由可变区域构成的 轻链化链)2分子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的副作用的主要 原因。 在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝试了对抑 制凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除了抑制凝聚体的生成W外，将 其除去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发一种简便且有效的凝聚体除去技术。 抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的模板化 (平台化)不断发展，在其初期纯化工序（回收工序）中，广泛利用将作为配体的蛋白质A固定 化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质(蛋白质A载体）。一般而言，使用在中性条件下 使抗体吸附于蛋白质A载体，并在酸性条件下洗脱抗体的方法，但通常通过3步色谱纯化而 使其高纯度化，在蛋白质A色谱工序的后段，可W通过离子交换色谱、疏水性相互作用色谱 等的组合来除去凝聚体等杂质(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、专利文献5)。 亲和配体具有与特定分子特异性结合的功能，将该配体固定化于水不溶性载体而 形成的亲和分离基质（也称为亲和色谱载体、亲和载体)用于从含有生物体成分、重组体的 微生物和哺乳类培养细胞中有效地分离纯化有用物质。作为实际工业上利用的抗体亲和配 体，例如可W举出：由蛋白质A、蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能 性修饰体(类似物)构成的肤性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体（弓夕歹一一本鎖)或抗体的 化受体等重组蛋白质性配体、及嚷挫衍生物等化学合成性配体，可W用于抗体医药品等的 纯化。抗体医药品相对于化学药品显示更低的毒性且显示更高的特异性，因此，作为理想的 医药品，其需求不断增高。 对于利用亲和载体的分离纯化而言，其课题在于抗体的凝聚体、源自宿主的杂质、 抗体的分解物等下称为凝聚体等)的除去。 例如，作为亲和载体的一个例子，在蛋白质A色谱工序中，通常进行酸性洗脱，但是 由于各种抗体的洗脱抑不同需要时间进行工艺设计，另外洗脱pH越低，形成凝聚体的风险 越高，因此，对蛋白质A配体进行了施加蛋白质工程学修饰的尝试，使得需要抑3左右的较低 pH洗脱的抗体也能够在P册.5~4左右洗脱(专利文献1)。 另外，蛋白质A色谱工序后凝聚体含量较多的情况下，在后段的杂质除去工序中会 导致目标单体(monomer)的收率降低，因此，除了尝试抑制蛋白质A色谱工序中的凝聚体形 成W外，还进一步尝试了除去该色谱工序中的凝聚体。 另外，在蛋白质A色谱工序的使用中对降低凝聚体等杂质进行了尝试。即，提出了 一种洗脱时的抑或离子强度的优化、W及划分洗脱峰的前半部分和后半部分等的方法。具 体而言，是利用由于作为蛋白质A载体的特性，多聚体化而成的抗体分子W比未多聚体化的 抗体分子有更高的概率与蛋白质A配体接触，因此，解离常数稍微变低，且基于微调疏水性 的分离机制的方法(专利文献2、专利文献3、专利文献4)。但是，运些方法难W进行严密的控 审IJ，而且分离性能较低，无法作为通常的分离方法使用，需要在后段工序中进行杂质除去。 蛋白质A色谱所代表的亲和色谱在酸性抑下实施洗脱，但后段的离子交换色谱、疏 水性相互作用色谱等通常在P册W上的抑下进行处理，因此需要调节pH、离子强度。 另一方面，阳离子交换载体通常在比其配体的地a更高的pH下使用。另外，对于使 用阳离子交换载体进行纯化的祀蛋白质，在比蛋白质的等电点(pi)更低的抑下进行吸附洗 脱。例如，在pl为8的抗体的纯化中，W地a为2左右的横酸基、pKa为3~5左右的簇基作为配 体的阳离子交换载体使用抑5~6的缓冲液实施吸附洗脱而进行纯化。缓冲液的抑可W设定 为配体的地a与祀蛋白质的pl之间，但使用pH越低于pi，蛋白质的正电荷越多，洗脱离子强 度需要设定得越高，存在回收率降低的倾向。在洗脱液的离子强度较高时，存在必须在后段 的工艺构建中降低离子强度等的限制。另外，在使用抑接近或低于阳离子交换配体的地a的 情况下，配体的负电荷会质子化，导致结合容量降低，通常不选择该情况。因此，在使用阳离 子交换载体的抗体的纯化中，可W对地曰2~5的阳离子交换载体使用抑5~6的缓冲液。 在亲和色谱工序之后使用阴离子交换色谱工序、疏水性相互作用色谱工序的情况 下(专利文献8)、在阳离子交换色谱工序之后进行阴离子交换色谱工序的情况下(专利文献 7)或在阳离子交换色谱工序中回收多种目标物质的情况下（专利文献6)，均同样地需要对 pH、离子强度进行调整。 对于如上所述对抗体等进行亲和色谱纯化、并在后段的工艺中进行高度纯化而 言，需要调整酸性抑洗脱液的抑、离子强度，连续的初期色谱在提高效率上受到限制。而且， 在进行未采用亲和色谱纯化方法的离子交换色谱工序和疏水性电荷诱导色谱工序时，需要 独立地进行各个工序，无法连续地纯化抗体等，在希望提高效率方面存在限制（专利文献 9)。 另外，抗体亲和分离基质对抗体显示出较高的特异性而能够高纯度化，但是，即使 严格地设定使用方法，单体(monomer)与凝聚体等的分离性能也较低，因此作为凝聚体等的 除去工序而旨存在限制。 现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本专利第4391830号公报专利文献 2:W02008/085988 专利文献3:日本特表2010-507583号公报 专利文献 4:W02010/019493 专利文献 5:W02010/141039 专利文献6:日本特开平05-202098号公报 专利文献7:日本特本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括：使用载体1和载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：水口和信，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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