本发明专利技术提供一种快速蛋白纯化组合层析柱、试剂盒及制备方法，层析柱包括柱体、离子交换树脂层、三片滤片、凝胶过滤树脂层、流出口，三片滤片分别设置于柱体内部底面、离子交换树脂层床面上和凝胶过滤树脂层床面上，滤片形状大小与柱体截面相同，孔径大于被分离蛋白，小于离子交换树脂和凝胶过滤树脂，流出口设置在柱体底部。本发明专利技术的一种快速蛋白纯化组合层析柱，用该层析柱进行蛋白分离与纯化，操作方便、快速，可大大节省时间，提高工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白分离纯化
，具体是涉及。
技术介绍
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之中分离纯化出所需要的目标蛋白质的方法，是生物
的一个重要技术。该技术难度、成本均高，例如一个生物药品成本的75%都花在了下游蛋白质分离纯化当中。蛋白质分离纯化技术主要有沉淀、透析、层析等，其中层析技术中的常用技术有离子交换层析和分子筛(凝胶过滤)。 离子交换层析(1n Exchange Chromatography, IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组份离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年,Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前，离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。根据离子交换树脂的性能，分为阳离子交换树脂与阴离子交换树脂。若被分离物质为带正电荷的碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂，而酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂，如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH值范围内带有何种电荷，作为交换剂的选择。离子交换树脂的优点主要是处理能力大，分离范围广，分离容量高，能除去各种不同的离子，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低(虽然一次投入费用较大)。 凝胶过滤是利用凝胶(如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)的多孔性，根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法。凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶过滤的优点主要有分离条件温和，蛋白质不易变性，收率高，重现性好，工作范围广，分离分子量的覆盖面大等。 由于离子交换树脂与凝胶过滤树脂的分离原理上不同，两种层析交替地使用可以用来分离、纯化高纯度蛋白。然而，这样的蛋白分离纯化过程是一个非常繁琐的过程。通常蛋白粗提液先被添加到离子交换树脂层析柱后，经过洗柱、梯度洗脱、收集不同时间流出的组分，使蛋白粗提液被分离成多个组分，每个组分还需经过其他方法(如SDS-PAGE凝胶电泳)进一步分析找出含目标蛋白组分，然后将含目标蛋白组分添加到凝胶过滤树脂层析柱上进一步分离，收集不同时间流出的组分，再经过其他方法(如SDS-PAGE凝胶电泳)分析找出含相对高纯度目标蛋白的组分。这样的蛋白分离纯化过程不仅需要多个层析柱，还需要设计复杂的缓冲液体系，没有专业培训，无法从事该类工作。因此，有必要开发一种简单的快速蛋白分离纯化层析柱。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种联合使用离子交换树脂与凝胶过滤树脂的层析柱，用该层析柱进行蛋白分离与纯化，操作方便、快速，可大大节省时间，提高工作效率。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是:一种快速蛋白纯化组合层析柱，包括柱体、离子交换树脂层、三片滤片、凝胶过滤树脂层、流出口，所述三片滤片分别设置于柱体内部底面、离子交换树脂层床面上和凝胶过滤树脂层床面上，滤片形状大小与柱体截面相同，孔径大于被分离蛋白，小于离子交换树脂和凝胶过滤树脂，流出口设置在柱体底部。 层析柱的柱体为塑料柱、玻璃柱或金属柱，柱体形状为圆柱形、方柱形或椭圆柱形，滤片为塑料滤片或纸滤片。 进一步的，所述离子交换树脂层的填充高度是柱体内径的0.3-3倍，所述凝胶过滤树脂层的填充高度是所述离子交换树脂层填充高度的2倍以上。 进一步的，所述凝胶过滤树脂层的填充高度是所述离子交换树脂填充高度的5-20倍之间。 一种制备上述快速蛋白纯化组合层析柱的方法，包括如下步骤: (I)选取层析柱空柱体，清洁后在柱体底部放入一片滤片； (2)取活化的凝胶过滤树脂或离子交换树脂，用水溶胀充分后，取少量装入柱体，靠重力沉降让水流出，反复装入树脂、沉降，如加入凝胶过滤树脂时，床面达到柱体内径的 0.6倍以上后，在床面上轻轻压入一片滤片，如加入离子交换树脂时，床面达到柱体内径的 0.3-3倍后，在床面上轻轻压入一片滤片； (3)取活化的凝胶过滤树脂或离子交换树脂，且与步骤(2)的树脂不相同，用水溶胀充分后，取少量添加在步骤(2)树脂层床面上的滤片上方，靠重力沉降让水流出，反复装入树脂、沉降，如加入凝胶过滤树脂时，床面达到步骤(2)加入的离子交换树脂床面高度的2倍以上后，在床面上轻轻压入一片滤片，如加入离子交换树脂时，当床面高度与步骤(2)加入的凝胶过滤树脂层床面高度的比值大于0，小于等于0.5后，在床面上轻轻压入一片滤片; (4)用50ml的30%乙醇水溶液，逐量添加于层析柱上，开放层析柱下方出口，反复添加至全部30%乙醇水溶液加入后，分别用上下盖子盖住层析柱下方出口嘴及层析柱上面柱口，置于冰箱4-8 °C冷藏备用。 一种含有上述快速蛋白纯化组合层析柱的一步法白介素纯化试剂盒，还包括缓冲液。 进一步的，所述缓冲液包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和TriS-HCl缓冲液中的一种或两种。 一种一步法白介素纯化试剂盒的使用方法，包括如下步骤: (I)取缓冲液用去离子水稀释成IX缓冲液； (2)取5倍于快速蛋白纯化组合层析柱中离子交换树脂和凝胶过滤树脂总体积量的IX缓冲液，逐量从柱上方添加于快速蛋白纯化组合层析柱，使其通过层析柱，以平衡柱内树脂缓冲体系； (3)将待分离的蛋白粗提液用该IX缓冲液透析过夜，或在待分离的蛋白粗提液中添加适量的浓缩缓冲液，使缓冲液的终浓度为IX，检测稀释后的蛋白粗提液pH值是否与原缓冲液的PH值相同，调节其pH值至与原缓冲液pH值相同； (4)取凝胶过滤树脂体积的1/10-1/20经步骤(3)处理的蛋白粗提液，加在经步骤(2)处理的快速蛋白纯化组合层析柱的上层树脂上，靠自重或压力差让蛋白粗提液流入树脂中，然后取3-5倍于快速蛋白纯化组合层析柱中树脂总体积量的IX缓冲液，让其自上而下通过层析柱，使目标蛋白被分离后流出，用紫外检测仪在280nm波长处检测流出峰，或将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线； (5)从检测到蛋白流出组分开始分量收集流出液组分，检测各流出液组分中目标蛋白纯度和含量，保存含有目标蛋白的流出液组分。 本专利技术具有的优点和积极效果是: 1、本专利技术采用将离子交换树脂和凝胶过滤树脂分层放入同一层析柱中，中间用滤片隔开，一次上柱即可同时进行离子交换层析与凝胶过滤层析，无需复杂的洗涤和梯度洗脱等程序，无需使用多个层析柱，操作便捷，普通实验人员在简单培训后即可熟练操作，节约时间，节省试剂耗材； 2、全部纯化过程只需要一种缓冲液，无需设计多种梯度盐度缓冲液及不同pH值的缓冲液，使操作简单、方便，提高工作效率； 3、本专利技术的包含快速蛋白纯化组合层析柱的白介素纯化试剂盒，一步法快速分离纯化白介素蛋白，获得高纯度的目标蛋白，使用方便，试剂成本低。 【附图说明】 图1是本专利技术的1-型快速蛋白纯化组合层析柱。 图2是本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速蛋白纯化组合层析柱，其特征在于：包括柱体、离子交换树脂层、三片滤片、凝胶过滤树脂层、流出口，所述三片滤片分别设置于柱体内部底面、离子交换树脂层床面上和凝胶过滤树脂层床面上，滤片形状大小与柱体截面相同，孔径大于被分离蛋白，小于离子交换树脂和凝胶过滤树脂，流出口设置在柱体底部。
【技术特征摘要】
1.一种快速蛋白纯化组合层析柱，其特征在于:包括柱体、离子交换树脂层、三片滤片、凝胶过滤树脂层、流出口，所述三片滤片分别设置于柱体内部底面、离子交换树脂层床面上和凝胶过滤树脂层床面上，滤片形状大小与柱体截面相同，孔径大于被分离蛋白，小于离子交换树脂和凝胶过滤树脂，流出口设置在柱体底部。2.根据权利要求1所述的一种快速蛋白纯化组合层析柱，其特征在于:所述离子交换树脂层的填充高度是柱体内径的0.3-3倍，所述凝胶过滤树脂层的填充高度是所述离子交换树脂层填充高度的2倍以上。3.根据权利要求2所述的一种快速蛋白纯化组合层析柱，其特征在于:所述凝胶过滤树脂层的填充高度是所述离子交换树脂层填充高度的5-20倍之间。4.一种制备权利要求1-3任一项所述层析柱的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)选取层析柱空柱体，清洁后在柱体底部放入一片滤片； (2)取活化的凝胶过滤树脂或离子交换树脂，用水溶胀充分后，取少量装入柱体，靠重力沉降让水流出，反复装入树脂、沉降，如加入凝胶过滤树脂时，床面达到柱体内径的0.6倍以上后，在床面上轻轻压入一片滤片，如加入离子交换树脂时，床面达到柱体内径的0.3-3倍后，在床面上轻轻压入一片滤片； (3)取活化的凝胶过滤树脂或离子交换树脂，且与步骤(2)的树脂不相同，用水溶胀充分后，取少量添加在步骤(2)树脂层床面上的滤片上方，靠重力沉降让水流出，反复装入树月旨、沉降，如加入凝胶过滤树脂时，床面达到步骤(2)加入的离子交换树脂床面高度的2倍以上后，在床面上轻轻压入一片滤片，如加入离子交换树脂时，当床面高度与步骤(2)加入的凝胶过滤树脂层床面高度的比值大于0，小于等于0.5后，在床面上轻轻压入一片滤片...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹潮，马蕾，
申请(专利权)人：哈德逊天津生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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