本发明专利技术公开了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种应用亲和层析法制备收率高、效价稳定的乌司他丁的方法。
技术介绍
乌司他丁(ULinastatin)系从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种酸性糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂，主要在肝脏中合成，由肾脏代谢随尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁由143个氨基酸组成，相对分子质量约37000~43000，属于蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用，还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、抑制心肌抑制因子(MDF)产生、清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。1909年欧洲首先报道人体尿液存在着胰蛋白酶抑制剂，随后人们发现，当人体受到感染、发热、肿瘤、妊娠、休克、手术、给予糖皮质激素等刺激时，人体尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先开发上市，在日本已作为急性胰腺炎、急性循环衰竭的治疗药物被广泛应用于临床。本专利技术人自2008年开始对UTI的生产工艺进行试验研究，采用现代蛋白质高端生化分离技术进行生产，使UTI的总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，生产工艺稳定，质s;可控。
技术实现思路
本专利技术提供了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，是为了攻克高岭土吸附、耐酸性混合模式吸附等传统方法提取乌司他丁收率过低、效价不高不稳定的缺点，采用亲和层析来纯化乌司他丁，从而提高了乌司他丁的收率，保证了效价的稳定。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案予以实现: 一种亲和层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，其特征在于:选用特异树脂的亲和层析来纯化乌司他丁，可以使总收率提高到70%以上，总效价不低于 5000iu/mgo该技术方案中，还具有以下技术特征:所述亲和层析法包括如下步骤: 1)乌司他丁粗加工 称取IT pH小于6.5的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质吸附完全后用氨水洗脱，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品。2)吸附柱层析(以0.25L柱体为例) 2.1)称取乌司他丁粗品1kg，用洗脱液A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液； 2.2)阴离子交换柱用洗脱液B平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在120~130mL/min左右； 2.3)用洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120~130mL/min，得洗脱液； 2.4)将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。3)亲和层析(以0.25L柱体为例) 3.1)用洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在120~130mL/min ； 3.2)上样结束后，用洗脱液C洗脱，流速120~130mL/min左右，收集洗脱液； 3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后，用洗脱液D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在120~130mL/min，密封待用； 3.4)洗脱液经超滤膜超滤至一定体积，超滤液中加入一定量磷酸氢二钠溶液，继续超滤至同一体积，然后再加入等量磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至相同体积。4)沉淀 超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。5)冻干 将沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。经核算，所得乌司他丁总收率高达70%以上，按中国药典所示方法测定，总效价高达 5000iu/mg 以上。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是: 选用亲和层析纯化乌司他丁，可以更有效的去除乌司他丁中的多种杂蛋白，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而使产品的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得乌司他丁总收率达到70%以上，总效价不低于5000iu/mg，创造了巨大的经济效益和社会效益。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，而不以任何方式限制。实施例1 1)乌司他丁粗加工 称取IT pH小于6.5的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入16.5kg甲壳质，并用精密pH试纸测定，调节尿液pH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脱lh，再经过3.5kg硫酸铵盐析，过夜沉淀、离心后置于用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品Ο2)吸附柱层析(以0.25L柱体为例) 2.1)称取乌司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脱液A溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液； 2.2)阴离子交换柱用2.5L的洗脱液A平衡，将上述离心液流经平衡好的阴离子交换柱，流速控制在120mL/min左右； 2.3)用33L的洗脱液B溶液洗脱，流速控制在120mL/min，得洗脱液； 2.4)将洗脱液经超滤膜，超滤至其体积的二十分之一，得超滤液约1.65L。3)亲和层析(以0.25L柱体为例) 3.1)用3.0L的洗脱液C平衡亲和层析柱，将超滤液流经平衡过的树脂柱，流速控制在120mL/min ； 3.2)上样结束后，用10L的洗脱液C洗脱，流速120mL/min左右，收集洗脱液； 3.3)柱中的亲和树脂经洗脱液C洗脱后，用5.0L的洗脱液D洗涤去除吸附在上面的杂质，流速控制在120mL/min，密封待用； 3.4)洗脱液经超滤膜超滤至170mL，超滤液中加入磷酸氢二钠溶液830mL，继续超滤至170mL，然后再加入830mL磷酸氢二钠溶液，再经超滤膜超滤至170mL。4)沉淀 超滤液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小时，离心，固体再用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物。当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纯化乌司他丁的方法，该方法包括：将乌司他丁粗品通过离子交换层析、超滤液沉淀、沉淀物冻干步骤进行纯化，所得纯化后的乌司他丁的总收率提高到70%以上，总效价不低于5000iu/mg。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘乃山，林晓磊，刘翠珍，
申请(专利权)人：青岛康原药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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