一种寨卡病毒抗原及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种寨卡病毒抗原及其应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明专利技术将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化pET30a质粒为基础载体，构建pZE400，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，该表达载体表达的蛋白带HIS标签于蛋白C端，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到寨卡病毒蛋白。该蛋白免疫原性好，特异性强，可用于制备寨卡病毒检测试纸条或试剂盒，也可用于制备寨卡病毒疫苗，市场价值显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒免疫领域，具体地，涉及寨卡病毒抗原及其应用。
技术介绍
寨卡病毒(ZikaVirus，ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，经由埃及伊蚊传播，能使受蚊叮咬的人罹患寨卡病毒感染症(亦称寨卡热)。该病毒最早在1947年从乌干达的寨卡森林中的猕猴体内分离得到，因而得名。依据基因型别分为亚洲型和非洲型两种型别，在中非、东南亚和印度等地都有发现的纪录。2015年起寨卡病毒疫情于中南美洲快速扩散，其中巴西甚至有超过4,100例新生儿小头畸形怀疑与寨卡病毒相关。寨卡病毒与登革热，黄热病，日本脑炎和西尼罗河病毒相近。它会导致一个类似温和形式的登革热的病情，目前还无法通过药物或疫苗来预防。寨卡病毒经由母亲传染给孩子，寨卡发烧可能和新生婴儿的小头畸形有关连，其对成人的感染能影响神经系统，而且可能也与格林－巴利综合征存在联系。寨卡病毒呈球形，直径约为40-70nm，有包膜。ZIKV核酸为一条长度为10794碱基的单正链RNA，其编码基因顺序为5’-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。RNA翻译为一个多聚蛋白，然后通过蛋白酶裂解为结构蛋白衣壳蛋白(capsid，C)、前体膜蛋白(precursormembrane，prM)、膜蛋白(envelope，E)，以及数个非结构蛋白。现在研究发现黄病毒的囊膜蛋白(E蛋白)主要负责病毒与感染宿主的受体的识别，介导病毒的入侵，因此是该类病毒最主要的保护性抗原。黄病毒的中和抗体一般通过靶向E蛋白阻止病毒的入侵，进而帮助宿主清除病毒。寨卡病毒E蛋白大约53kDa，是病毒的主要表面蛋白。无论是制作寨卡病毒检测试剂还是寨卡病毒疫苗，获得良好高纯度的活性抗原是必须解决的问题。因此有必要对寨卡病毒E蛋白进行研究，建立针对寨卡病毒E蛋白的原核表达及纯化表达工艺，获得生物学活性好的寨卡病毒抗原，以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过寨卡病毒E蛋白进行分析和筛选，对寨卡病毒的天然序列进行片段化后人工再排列，通过对经过人工拼接后的寨卡病毒E蛋白序列进行原核表达及纯化表达工艺，进而获得生物学活性高的寨卡病毒抗原。本专利技术的第一个方面提供了一种寨卡病毒抗原，具有：(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。SEQIDNO.1所示的抗原蛋白大小为69kDa，该设计并非完整的寨卡病毒E蛋白，而是对寨卡病毒的天然序列进行片段化后人工再排列，对特定序列进行了2次重复拼接，连接序列为GGGS。本专利技术的第二个方面是提供编码所述寨卡病毒抗原的基因。优选的，所述基因具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个方面是提供了所述寨卡病毒抗原的原核表达载体。优选的，所述原核表达载体是将SEQIDNO.2所示的核苷酸序列与pET30a载体进行连接所获得的，优选的，所述原核表达载体为pZE400。本专利技术的第四个方面是提供含有所述的寨卡病毒抗原、其编码基因或原核表达载体的宿主细胞。可选的，所述宿主细胞可以为BL21(de3)大肠杆菌株。本专利技术的第五个方面提供所述所述寨卡病毒抗原的纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入NdeI和XhoI酶切位点，以商品化质粒为基础载体，构建寨卡病毒表达载体，所述蛋白序列如SEQIDNO.1所示，所述DNA序列如SEQIDNO.2所示，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到寨卡病毒蛋白。含有氨基酸序列如SEQIDNO.1所示寨卡病毒抗原的生物制品属于本专利技术的保护范围。优选地，所述的生物制品为疫苗。含有氨基酸序列如SEQIDNO.1所示寨卡病毒抗原的检测试剂属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了氨基酸序列如SEQIDNO.1所示寨卡病毒抗原在制备用于检测寨卡病毒的试剂盒或检测试剂中的用途。可选的，所述试剂盒为ELISA试剂盒或胶体金法快检试剂盒。本专利技术提供了氨基酸序列如SEQIDNO.1所示寨卡病毒抗原在制备寨卡病毒疫苗中的用途。本专利技术提供的上述寨卡病毒抗原免疫原性好，特异性强，可作为寨卡病检测的分子标记用于检测寨卡病毒，还能够用于制备检测寨卡病的试剂盒或试纸条或检测试剂，灵敏度高特异性强，有助于寨卡病毒抗原检测的规范化与标准化，还可用于制备寨卡病毒疫苗。附图说明图1为本专利技术寨卡病毒抗原蛋白表达载体pZE400图谱。图2为纯化前后寨卡病毒抗原蛋白电泳图。箭头所指为纯化后的蛋白。蛋白大小是69kD。图3为本专利技术寨卡病毒抗原蛋白用于ELISA检测的原始结果截图。图中第一列为检测IgG的原始结果。其中第1孔为感染者阳性IgG血清，第2孔为十倍稀释阳性血清。其余为阴性血清。通过本实验判断寨卡病毒抗原蛋白能够与感染者IgG相结合。第二列为检测IgM的原始结果。其中第1孔为感染者IgM阳性血清，第2孔为十倍稀释阳性血清。其余为阴性血清。通过本实验判断寨卡病毒抗原蛋白能够与感染者IgM相结合,但结合效果较IgG稍差。图4为本专利技术寨卡病毒抗原蛋白制成胶体金试纸条的原始结果截图。左一是检测感染者IgG阳性血清，左二检测感染者IgM阳性血清，右一和右二均是阴性血清。T表示检测线，C表示控制线。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。实施例1寨卡病毒抗原蛋白的制备和纯化分别用限制性内切酶NdeI和XhoI对SEQIDNO.2所示的核苷酸序列进行消化，收集目的片段与同样用限制性内切酶处理的pET30a载体进行连接，构建重组表达质粒pZE400；E蛋白表达，SDS-PAGE电泳和图像分析系统确定表达情况和产量。1将重建完成的质粒pZE400转入BL21(de3)大肠杆菌株，涂布平板，挑取单克隆在5mlLB培养基(A+，50mg/ml)的中试管内，37℃240rpm过夜培养。2将过夜培养的菌株，接种在含有300mlLB培养基(A+，50mg/ml)中，37℃240rpm继续培养，待菌液OD600约1的时候，加入终浓度为1mm的IPTG诱导3个小时。34000rpm离心，收取菌体，用10mmTris-HclpH8.0，0.5％TritonX-10的缓冲液按照30ml缓冲液每升培养液的比例重悬，可在-20℃保存。寨卡病毒蛋白的表达产物为包涵体，重悬后的菌体采用超声破碎，超声功率300w，20s工作，20s间隔，冰浴中破碎20次，不小于10000g离心10分钟，弃上清，保留沉淀，用8m/L尿素(10mmTrisph8.0)溶解沉淀，随后采用亲和层析纯化。纯化时基液采用8m/L尿素(10mmtrisph8.0)，洗脱液添加终浓度为30mm/L，60mm/L，300mm/L的咪唑梯度洗脱。收取300mm/L的咪唑洗脱液流过的峰值，SDS-page电泳检测目的蛋白的浓度和纯度。纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用BIORAD公司蛋白质定量试剂(proteinassay)比色测定蛋白质的含量。上述实验结果如下：1)含pZE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寨卡病毒抗原，其特征在于，具有：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2016.07.04 CN 201610518145X1.一种寨卡病毒抗原，其特征在于，具有：(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列(2)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的寨卡病毒抗原的基因，其特征在于，具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述基因的表达载体。4.含有权利要求1所述的寨卡病毒抗原或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。5.权利要求1所述寨卡病毒抗原的表达纯化方法，将经过D...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹健荣，林小靖，
申请(专利权)人：德诺杰亿北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11