蛋白缀合物制造技术

本发明专利技术涉及适于产生具有改进的血浆半衰期的药物的缀合肽的领域。特别地，本发明专利技术涉及通过经由微生物谷氨酰胺转移酶(MTGase)的酶促反应获得的缀合蛋白、和用于从肽或重组蛋白移除残余的谷氨酰胺转移酶的改进的方法，所述肽或重组蛋白通过微生物谷氨酰胺转移酶(MTGase)在谷氨酰胺侧链处经过酰胺键合酶促地缀合至亲水性非免疫原性聚合物，允许获得纯化的缀合肽或蛋白，所述纯化的缀合肽或蛋白对肽或蛋白部分和亲水性聚合物之间的酰胺键的酶促水解是稳定的，并且没有产物衍生的降解，展示了药物所需的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】蛋白缀合物 专利
本专利技术涉及适于产生具有改进的血浆半衰期的药物的缀合肽的领域。特别地，本 专利技术涉及通过经由微生物谷氨酰胺转移酶（MTGase)的酶促反应获得的缀合蛋白、和用于 制备高度纯的缀合蛋白的改进的方法，所述高度纯的缀合蛋白没有产物衍生的降解并且呈 现出改进的储存期。 现有技术 与生物相容的、高分子量的聚合物缀合是用于增加治疗肽或蛋白的半衰期和用于 改进其持久性效果的最常用技术之一。特别地，在已经被广泛利用的所谓的聚乙二醇化反 应中，将选择的蛋白共价地结合至具有从1，000-2, 000道尔顿（Da)至20, 000-40, OOODa或 甚至更高的分子量的一种或更多种线性的或支化的聚乙二醇（PEG)链。通常，聚乙二醇化 蛋白示出较低的肾清除率、以及较高的稳定性和减少的免疫原性。当多肽与PEG合适地结 合时，其流体力学体积增加并且其物理化学性质被修改，而诸如体外活性或受体识别的基 本的生物学功能可以保持不变、经历减少或在一些情况下完全被根除。PEG缀合掩蔽了蛋 白表面并且增加其表观分子尺寸，因此减小肾超滤，防止与抗体或抗原呈递细胞（antigen processing cell)相互作用并且减少蛋白水解降解。最后，PEG缀合向聚乙二醇化分子赋 予其物理化学性质并且因此肽和非肽药物生物分布和溶解度也被修改。用于蛋白缀合的另 一选择（作为PEG的替代方案）是利用其它线性的或支化的生物相容性聚合物，诸如例如 右旋糖酐、聚（乙烯吡咯烷酮）、聚（丙烯酰吗啉）、聚多糖等等。 聚乙二醇化通常通过氨基酸反应性侧链和合适地官能化的甲氧基-PEG(m-PEG) 之间的化学反应来进行。 通常利用的化学聚乙二醇化技术在以下出版物中描述： -S. Zalipsky,Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev. , 16?157-182?1995 ； -F. M. Veronese, Peptide and Protein PEGylatioma Review of Problems and Solutions，Biomaterials，22,405-417, 2001。 -S. Jevsevar, M. Kunstel j, V. G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins，Biotechnol. J. 5,113 - 128, 2010。 除了化学聚乙二醇化之外，结合m-PEG链和蛋白的酶促程序已经被描述。例如， 这些基于利用原核和真核起源两者的谷氨酰胺转移酶类以催化将用伯氨基官能化的m-PEG 转移至感兴趣的多肽链中天然存在的或通过位点特异性诱变反应插入的谷氨酰胺残基的 酉先基（H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of ProteinsjAdv. Drug Deliv. Rev.，54,487-504, 2002) 〇 例如，EP785276和US6010871二者描述使用微生物谷氨酰胺转移酶（MTGase)将 聚合物链连接至在其氨基酸序列中具有至少一个谷氨酰胺残基的肽和蛋白。在这些专利 中，尽管给出了在一些模型蛋白上的单取代的实例，但不清楚的是取代是否也是位点特异 性，这意指它们产生单分子形式或位置异构体的混合物，在位置异构体的混合物中，尽管被 单取代，聚合物链与不同的谷氨酰胺结合。 在另一方面，EP2049566和US7893019二者公开通过使用MTGase的酶促反应在谷 氨酰胺135处选择性地单聚乙二醇化的新的G-CSF类似物。 然而，上文报道的专利和论文中不重视由酶促反应产生的聚乙二醇化产物的纯化 方法，特别地考虑到产物中污染性的残余的MTGase的量，所述残余的MTGase意外地仍然能 够水解缀合的PEG分子并且产生产物衍生的异质性。 正日益感到对开发允许维持稳定的治疗性蛋白（therapeutic protein)的方法的 需求和重要性。 因此，本专利技术的目的是开发允许减少在缀合反应之后存在并且在其储存期间降解 缀合的药物的残余的MTGase污染物的方法。 专利技术概述 本专利技术涉及通过经由微生物谷氨酰胺转移酶（MTGase)的酶促反应获得的缀合蛋 白，其特征在于以下事实：在纯化的产物中残余的MTGase的含量不高于3p. p. m，所述缀合 蛋白在2°C至8°C范围内的温度下呈现出至少36个月的储存期。 在另外的方面中，本专利技术涉及用于通过阳离子交换色谱法纯化通过经由谷氨酰胺 转移酶的酶促反应获得的缀合蛋白的方法。 如将在专利技术详述中另外描述的，本专利技术的方法具有允许获得高度纯的缀合的治疗 性蛋白的优点。 根据本专利技术，用于纯化缀合蛋白的方法包括以下的步骤： a.使阳离子交换色谱柱达到小于4的pH; b.将色谱柱装载有在步骤a.的柱上具有小于4的pH的含有聚乙二醇化蛋白的反 应混合物； c.将步骤b.的色谱柱用具有小于4的pH的洗脱剂洗脱， 从而收集含有具有低于或等于缀合蛋白的总量的3ppm的残余的微生物谷氨酰胺 转移酶含量的缀合蛋白的级分（fraction)，所述缀合蛋白在从2°C至8°C范围内的温度下 呈现出至少36个月的储存期。 本专利技术的另外的方面是通过本文描述的方法可获得的缀合蛋白和包含所述缀合 蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。 附图简述 从下文报道的详细描述、从被给出用于例证性和非限制性的目的的实施例以及从 所附的图1-8中，本专利技术的特征和优点将是明显的，其中： 图1:示出MTGase的RP-HPLC荧光测定。MTGase的RP-HPLC荧光测定。校正曲线 (a)和在7. 3min时荧光底物CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS从在8.Omin时荧光产物CBZ-Gln(Gly-CAD-DNS) -Q-NH-CH2-CH2-0-Me的RP-HPLC分离（b)。 图2:示出在MTGase存在下在约30min后（a)和在16小时后（b)的Met-G-CSF和 mPEG-NH2 20kDa的反应混合物的SE-HPLC色谱图，所述色谱图示出Met-G-CSF(以11. 5min 的保留时间洗脱）被聚乙二醇化以给出Met-G-CSF-Glnl35-PEG 20kDa(保留时间7. 9min)。 在13min洗脱的峰是由于溶剂前沿。 图3:示出在pH 5下MTGase从Macrocap SP柱的洗脱图。 图4:示出在pH 5下聚乙二醇化Met-G-CSF和MTGase从Macrocap SP柱的洗脱 图。 图5:示出在MTGase分离级分26-40 (a)中和在聚乙二醇化Met-GCSF+MTGase级 分21-58 (b)和级分66-75 (c)中的残余的MTGase的RP-HPLC荧光测定。 图6 :示出在50ppm的MTGase存在下在5°C下储存1个月之前（a)和之后（b)的 纯化的 r-Met-G-CSF-Q135-PEG 20kDa 的 IE-HPLC。Met-G-CSF 在 7. 5-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缀合蛋白，所述缀合蛋白通过由微生物谷氨酰胺转移酶(MTGase)催化的酶促反应获得，其特征在于以下事实：在纯化的产物中残余的MTGase含量不高于5p.p.m，所述缀合蛋白在从2℃至8℃范围内的温度下呈现出至少24个月的储存期。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹卡洛·托农，加埃塔诺·奥尔西尼，鲁道夫·施雷普菲尔，
申请(专利权)人：拜欧克尔有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT