一种嗜低温蛋白酯酶E10及其表达纯化、晶体结构和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种来源于海洋细菌E4A9

A low temperature protein esterase E10 and its expression, purification, crystal structure and Application

The invention belongs to the technical field of biology, in particular to a bacterium derived from marine bacteria E4A9

【技术实现步骤摘要】
一种嗜低温蛋白酯酶E10及其表达纯化、晶体结构和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种来源于海洋细菌蛋白酯酶及其表达纯化、晶体结构以及在手性药物前体筛选以及制备工业酶制剂中的应用。
技术介绍
酯酶(esteraseEC3.1.1.1)是一类能够将脂类通过化学反应分解为酸和醇的水解酶类。酯酶通常存在一个由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸三个氨基酸残基组成的催化三角为其活性中心；其中，丝氨酸残基经常出现在GXSXG这样一个保守的五肽序列中。大部分酯酶催化反应时不需要辅助因子参与，并且对反应底物具有广泛性和一定的立体结构特异性，这些特性使其作为一种生物催化剂越来越受到人们关注。如今，酯酶作为一种环境友好、经济并且清洁的催化剂，在食品、造纸、精细化学合成以及医疗诊断等领域扮演着越来越重要的角色。工业上应用的酯酶主要来源于不同的生物体内，特别是来自于真菌和细菌，这主要是由于微生物来源的酯酶具有产量高、反应稳定、副产物毒性小及分子生物学操作简单等优点。海洋来源的酯酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以及优异的手性选择性等等，因此，从海洋微生物中筛选出独具特性的酯酶就成了手性药物前体筛选及开发新型工业酶制剂的一个重要方向。本专利技术利用结晶的方法得到了酯酶E10的蛋白晶体并解析了其三维结构。E10晶体结构可在手性药物前体筛选、工业酶制剂中底物改造及提高酶活方面具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于海洋细菌的蛋白酯酶E10及其表达纯化、晶体结构和应用。本专利技术包括提供对来源于海洋细菌CroceicoccusmarinusE4A9T的酯酶E10进行基因工程改造，以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及所述酯酶E10第12位到第205位氨基酸的三维晶体结构及其在工业方面的应用。本专利技术首先提供一种来源于海洋细菌CroceicoccusmarinusE4A9T的酯酶E10，其含有205个氨基酸，分子量为22.36kDa；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，核酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本专利技术还对来源于海洋细菌CroceicoccusmarinusE4A9T的酯酶E10进行基因工程改造，将其全长基因克隆在pSMT3的载体上。本专利技术优先选择使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其它细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对以上所述蛋白以融合蛋白的方式进行表达，优先选择了His标签得到了可溶性表达(但不排除其它标签，如MBP或GST等标签也有可溶性表达)。本专利技术还提供一种表达和纯化来源于海洋细菌CroceicoccusmarinusE4A9T的酯酶E10的方法，该方法包括：构建融合未突变的E10全长基因的重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白E10，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法，优选Ni亲和层析(分离原理为：低咪唑浓度缓冲液进行上样，高咪唑浓度缓冲液进行洗脱)分离目的蛋白，再通过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的E10的蛋白。其中，扩增酯酶全基因的上游引物为：E10F(5’-TCGCGGATCCGTGGCGGACGGCGAGGC-3’，BamHI)(SEQ.ID.NO.3)下游引物为：E10R(5’-TCCGCTCGAGCTAGAGGTCGTCGATCCTGTC-3’，XhoI)；(SEQ.ID.NO.4)表达质粒为pSMT3，转化方法为CaCl2转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5α，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。其中，所述Ni亲和层析的平衡缓冲液优先选择50mMTris(pH8.0)，500mMNaCl，5％甘油，10mM咪唑，2mMβ-Me，0.2mMPMSF。所述Ni亲和层析洗脱缓冲液优先选择50mMTris,pH8.0，500mMNaCl，5％甘油，250mM咪唑，2mMβ-Me；所述凝胶过滤层析的缓冲液优先选择20mMTris(pH7.4)，100mMNaCl，2mMDTT。本专利技术还提供对上述得到的酯酶E10进行结晶的方法，具体步骤为：将酯酶E10浓缩至浓度为10-40mg/ml，使用结晶试剂盒(来自HamptonResearch等公司的CrystalScreenKitI/II,Index,Salt,PEG/Ion等)作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴气相扩散法进行结晶。温度为4-25摄氏度，优先选择使用18摄氏度。结晶条件：采用悬滴气相扩散法进行结晶，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂体积比在2:1至1:2的范围内，优选体积比为1:1，蛋白溶液中蛋白质浓度为20-30mg/ml，结晶条件为150mM乙酸钙，100mM咪唑(pH8.5)，10％PEG8000。晶体培养在4至25摄氏度(优选18摄氏度)进行。本专利技术还提供衍射性能良好的酯酶E10蛋白质的晶体。本专利技术还提供酯酶E10(酯酶E10第12位到第205位氨基酸)的三维结构，该结构描述了酯酶E10的二级结构组成，肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中，针对酯酶E10蛋白进行衍射，得到酯酶E10蛋白的晶体衍射数据，以来源于细菌Pseudomonasaeruginosa的同源的GDSL家族酯酶TesA(PDBID:4JGG)为模型进行结构解析，最终得到酯酶E10蛋白的三维结构。在具体的实施方式中，提供了酯酶E10的晶体三维结构，其中，所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少一部分的原子坐标，或者任何与该坐标中至少40％氨基酸残基的主链碳骨架的原子三维坐标的平均根方差小于或等于的结构。本专利技术获得了优选酯酶E10的晶体三维结构，分辨率为其晶体结构空间群为C2。晶胞参数为：α＝γ＝90.000°，β＝99.055°。本专利技术所述的酯酶E10或其可折叠部分的晶体结构，具有图1中列出的原子坐标(x,y,z)±(1.0,1.0,1.0)确定的三维结构。在一具体的实施方式中，所述的酯酶E10的三维结构在一个晶体学不对称单位内有两个蛋白分子。该结构共由5个β折叠、9个α螺旋及3个310螺旋组成。其中，所述的5个β折叠位于中心，所述的9个α螺旋围绕在β折叠的周围。其中，β折叠1，即含Ile21-Gly27的氨基酸区段；α螺旋1，即含Ser29-Ala32的氨基酸区段；310螺旋1，即含Arg38-Glu40的氨基酸区段；α螺旋2，即含Tyr42-Arg53的氨基酸区段；β折叠2，即含Val57-Gly63的氨基酸区段；α螺旋3，即含Thr69-Ser82的氨基酸区段；β折叠3，即含Leu89-Glu93的氨基酸区段；α螺旋4，即含Ala96-Arg101的氨基酸区段；α螺旋5，即含Ala105-Ser170的氨基酸区段，β折叠4，即含Val126-Tyr129的氨基酸区段；310螺旋2，即含Pro135-Leu137的氨基酸区段；α螺旋6，即含Gly139-Asp146的氨基酸区段；α螺旋7，即含Ser147-Tyr156的氨基酸区段；β折叠5，即含Glu159-Val161的氨基酸区段；α螺旋8，即含Ile165-Phe170的氨基酸区段；310螺旋3，即含Ala172-Leu174的氨基酸区段；α螺旋9，即含Ala184-Asp20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于海洋细菌E4A9

【技术特征摘要】
1.一种来源于海洋细菌E4A9T的酯酶E10，其含有205个氨基酸，分子量为22.36kDa；氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.一种如权利要求1所述的来源于海洋细菌E4A9T的酯酶E10的表达和纯化方法，其特征在于，包括：构建融合未突变的E10全长基因的重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白E10，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法，分离目的蛋白，再通过凝胶过滤层析方法，得到高纯度的E10的蛋白；其中，扩增酯酶全基因的上游引物为：E10F（5’-TCGCGGATCCGTGGCGGACGGCGAGGC-3’，BamHI），下游引物为：E10R(5’-TCCGCTCGAGCTAGAGGTCGTCGATCCTGTC-3’，XhoI)；表达质粒为pSMT3，转化方法为CaCl2转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5α，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。3.一种如权利要求1所述的来源于海洋细菌E4A9T的酯酶E10的结晶方法，其特征在于，具体步骤为：将酯酶E10浓缩至浓度为10-40mg/ml，使用结晶试剂盒作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴气相扩散法进行结晶，温度为4-25摄氏度。4.一种如权利要求1所述的来源于海洋细菌E4A9T的酯酶E10的晶体三维结构，其特征在于，晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少40%的原子坐标，或者至少40%氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与1中的坐标的平均根方差小于或等于1.9Å。5.根据权利要求4所述的酯酶E10的晶体三维结构，其特征在于：分辨率为1.9Å；其中，所述酯酶E10的晶体结构空间群为C2，一个不对称单位含有两个分子；晶胞参数为：a=116.655Å，b=37.019Å，c=99.747Å，α＝γ＝90.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继喜，李正阳，赵玉，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31