一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法技术

本发明专利技术一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，包括以下步骤：(1)磷脂酶印迹激活：(2)印迹磷脂酶固定化：加入硅藻土，充分震荡混匀、静置，完成固定化吸附；(3)冻干：(4)洗涤(5)脱溶：将洗涤好的酶粉进行真空干燥，除去残留的有机溶剂，得成品酶粉。本发明专利技术具有工艺简单，激活效果明显，生产成本低，能够提高酶催化活力及底物特异性，在油脂精炼应用中降低精炼油磷脂含量，提高成品油产率，具有很高的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工催化剂活化领域，特别涉及一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法。
技术介绍
磷脂酶(Phospholipase,EC3.1.1.4；EC3.1.1.3；EC3.1.4.4；EC3.1.1.5)是一大类具有重要价值的水解酶，具有催化磷脂类化合物的合成、水解、转酯、酯交换等多种反应的能力，是化工生产，医药合成及食品加工中最重要的酶之一。常见磷脂酶主要包括磷脂酶A1，磷脂酶A2，磷脂酶C，磷脂酶D等几类。例如磷脂酶A1和磷脂酶A2，能在油水界面上催化磷脂及甘油三酯α位和β位的酯水解、醇解、酯合成、酯交换等反应，在食品、化工，特别是油脂精炼等多个领域被广泛应用。磷脂酶C催化甘油与磷酸基团之间磷酸酯键等合成与断裂，主要用于油脂精炼行业。磷脂酶D催化磷脂中磷酸基团与碱基之间等水解、合成、转酯等，在医药化工行业中具有重要地位。对绝大部分常规酶来说，催化反应是在水溶液环境中进行的，有机溶剂能明显降低酶的催化能力，甚至使酶失活，但不少具有重要价值的产品的合成和一些重要的反应需要在非水相环境中尤其是有机溶剂中进行，如毛油及混合油的酶法精炼。因此，提高酶在非水相催化过程中的性能就成为了研究的热点。非水相酶催化概念由Zaks和Klibanov在1984年提出，他们发现某些脂肪酶在有机溶剂环境下仍具有一定的催化活力，并以此为基础合成了一系列有机化合物。经过几十年的发展，非水相酶催化技术得到一定的发展，溶剂系统不再局限在单一有机溶剂，所使用酶的种类也得到了进一步拓展。相较于非生物催化化工及水相生物催化，非水相酶催化具有一定优势，主要表现在增加底物有效浓度；反应平衡向合成方向移动；微生物污染少；酶热稳定性提高；酶重复使用性提高；下游过程能耗降低；减少副反应；提高酶特异性和选择性等方面。然而，非水相中酶活性不高始终是制约该技术发展进入工业应用的最大因素。随着相关研究的不断推进，深入探讨酶在有机相中活力降低的原因，发现这些原因是可以解决的，通过合理的、系统的策略设计，及酶激活改性，可多数量级的提高酶在有机相中的活力，并最终达到酶在水相中的活力水平。磷脂是毛油中的主要杂质之一，以溶质状态均匀分散在毛油或混合油中。磷脂在高温条件下，容易发生化学反应生成深色色素及异味化合物，更高温度下脱水焦化，严重影响食用油品质。磷脂含量较高的食用油在后期储藏过程中，极易氧化酸败，品质劣变。因此，去除毛油中的磷脂是油脂精炼过程中重要的一环，该过程也叫毛油脱胶。工业上常用的水化脱胶，利用磷脂分子的两亲性质，往毛油中加入一定量的水，卵磷脂等亲水性较强的磷脂吸水膨胀，聚团形成胶状沉淀从毛油中分离出来。但非水化磷脂，特别是磷脂酸钙镁盐，不能以这种形式从毛油中分离。酶法脱胶可以利用磷脂酶的催化活力，将非水化磷脂转化为亲水性更强的溶血磷脂进而水化分离，或者切除磷酸基团，将其转化为二酰甘油，以达到脱除磷脂的目的。由于毛油脱胶体系与常规水相反应体系差异较大，特别是在混合油体系中，正己烷或轻质溶剂油对酶活力有强烈抑制作用，很多磷脂酶不能像在水溶液中一样表现较高的活力，提高磷酯酶在非水相条件下的活力意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种适用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，包括以下步骤：(1)磷脂酶印迹激活：将磷脂酶溶解于含印迹因子的缓冲液中进行激活，印迹因子为磷脂或其衍生物；(2)印迹磷脂酶固定化：加入硅藻土，充分震荡混匀、静置，完成固定化吸附；(3)冻干：将完成固定化及抗冻保护的印迹磷脂酶进行预冻，再进行真空冷冻干燥呈粉末，即为固定化印迹磷脂酶粉；(4)洗涤：固定化印迹磷脂酶粉中加入洗涤液，充分涡旋振荡分散，静置后滤去溶剂，重复洗涤，洗去印迹因子；(5)脱溶：将洗涤好的酶粉进行真空干燥，除去残留的有机溶剂，得成品酶粉。优选地，步骤(1)中缓冲液浓度为10～500mMol/L，激活条件为4～40℃、2～30min。优选地，步骤(1)中所述的印迹因子与缓冲液的体积比为1:10～250。优选地，步骤(1)中所述的缓冲液为柠檬酸或磷酸或Tris-HCl；所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D中的一种；所述磷脂或其衍生物为磷脂酸、磷脂钙盐、磷脂镁盐的一种。其中柠檬酸及磷酸是现有油脂精炼工业中最常用的酸化剂，Tris-HCl是生化反应常用pH缓冲系统，酸-盐缓冲范围与本专利技术涉及酶最适pH范围相符，且不会干扰成品酶剂的使用。优选地，步骤(2)中静置的温度为4～40℃、时间为2～30min。优选地，步骤(2)中的硅藻土是按照上一步骤体系体积的10～100％(w/v)加入。优选地，步骤(3)中预冻的温度为-20～-80℃，真空冷冻干燥的条件为温度为-60～-80℃、真空度1～500Pa。当温度高于-20℃时，含印迹因子、酶蛋白及缓冲盐的印迹体系难以充分冻结，在真空干燥过程中会造成大量气泡鼓出，成品得率降低等不良后果。优选地，步骤(4)中，按照固定化印迹磷脂酶粉2～10倍体积加入洗涤液，涡旋振荡分散的温度为4～40℃，静置时间为2～30min，重复洗涤次数为3～4次。本专利技术使用的印迹激活剂在油脂精炼过程中为难脱除杂质，该激活剂易溶解于非极性有机溶剂，考虑到后续脱溶条件及有机溶剂对酶蛋白的变性影响，优选洗涤液为正己烷、石油醚，乙醚中的一种。洗涤条件低于该提出范围，印迹因子残留对后续使用的不良影响不能被忽略。优选地，在步骤(1)、(2)之间还进行抗冻保护，在激活的印迹磷脂酶中加入抗冻保护剂，混合均匀、静置后，完成抗冻保护。优选地，所述的抗冻保护剂为甘油或甘露糖；抗冻保护剂浓度为0～500mMol/L，静置的温度为4～40℃、时间为2～30min。甘油及甘露糖是生化常用抗冻保护剂，且具有无毒，水溶，对后续步骤及成品使用无不良影响的特点。在该范围内，抗冻保护剂能有效保护酶活性不在预冻及冷冻真空干燥环节中降低，更高浓度的抗冻保护剂条件下，洗涤印迹因子环节难度加大，且成品酶剂不易保持粉末性状，影响后续保存使用。本专利技术的优点是：本专利技术利用磷脂酶蛋白分子构象在水相中的柔性，采用冷冻干燥的方法将磷脂酶蛋白构象进行诱导固化，使之保持适合与底物结合的状态，利于催化反应进行。由于在非水介质中磷脂酶蛋白构象相对刚性，该方法所提供的磷脂酶高催化活性构象更容易得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)磷脂酶印迹激活：将磷脂酶溶解于含印迹因子的缓冲液中进行激活，印迹因子为磷脂或其衍生物；(2)印迹磷脂酶固定化：加入硅藻土，充分震荡混匀、静置，完成固定化吸附；(3)冻干：将完成固定化及抗冻保护的印迹磷脂酶进行预冻，再进行真空冷冻干燥呈粉末，即为固定化印迹磷脂酶粉；(4)洗涤：固定化印迹磷脂酶粉中加入洗涤液，充分涡旋振荡分散，静置后滤去溶剂，重复洗涤，洗去印迹因子；(5)脱溶：将洗涤好的酶粉进行真空干燥，除去残留的有机溶剂，得成品酶粉。

【技术特征摘要】
1.一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，其特征在于，包括以
下步骤：
(1)磷脂酶印迹激活：将磷脂酶溶解于含印迹因子的缓冲液中进行激活，
印迹因子为磷脂或其衍生物；
(2)印迹磷脂酶固定化：加入硅藻土，充分震荡混匀、静置，完成固定化
吸附；
(3)冻干：将完成固定化及抗冻保护的印迹磷脂酶进行预冻，再进行真空
冷冻干燥呈粉末，即为固定化印迹磷脂酶粉；
(4)洗涤：固定化印迹磷脂酶粉中加入洗涤液，充分涡旋振荡分散，静置
后滤去溶剂，重复洗涤，洗去印迹因子；
(5)脱溶：将洗涤好的酶粉进行真空干燥，除去残留的有机溶剂，得成品
酶粉。
2.根据权利要求1所述的一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，
其特征在于，步骤(1)中缓冲液浓度为10～500mMol/L，激活条件为4～40℃、
2～30min。
3.根据权利要求1所述的一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，
其特征在于，步骤(1)中所述的印迹因子与缓冲液的体积比为1:10～250。
4.根据权利要求1所述的一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法，
其特征在于，步骤(1)中所述的缓冲液为柠檬酸或磷酸或Tris-HCl；所述磷脂
酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D中的一种；所述磷脂或其衍
生物为磷脂酸、磷脂钙盐、磷脂镁盐的一种。
5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，李哲敏，王鹏，刘会，赵根海，王丽，王晗，孙小雯，吴荷芳，尉鸿飞，孙孝娟，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34