用于纯化抗体的方法技术

本发明专利技术描述了通过离子交换层析纯化免疫球蛋白的方法。该层析法使用弱离子交换树脂和单步骤洗脱法纯化免疫球蛋白。本发明专利技术另外描述了用于确定免疫球蛋白从离子交换树脂单步骤洗脱的盐浓度的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及多肽纯化领域。本文描述了使用离子交换树脂纯化免疫球 蛋白的新方法。本文同时提供了快速确定纯化条件的方法。
技术介绍
蛋白质，尤其是免疫球蛋白在当今的医学领域中起着重要作用。对于 人的应用，每一种药物必须满足独特的标准。为确保生物药剂对人的安全 性，尤其要除去可导致严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为满足 质量管理规格标准，必须在生产过程之后进行一个或多个纯化步骤。其中， 纯度、生产量和产率在确定合适的纯化方法中起着重要作用。已良好地建立不同的方法并且已将其广泛地用于蛋白质的纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换 层析(例如，阳离子交换(羧曱基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模 式的交换)、亲硫吸附(例如使用p-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水性相互 作用或芳香族化合物吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树 脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和 材料)、大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电脉、毛细管电泳) (Vijayalakshmi， M.A.， Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。Necina， R.等人，Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698，报导了通过表 现为高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液直接捕获人单克隆抗 体。在WO 89/05157中，报导了通过直接对细胞培养基进行阳离子交换处 理纯化产物免疫球蛋白的方法。Danielsson， A.等人,J. Immun. Meth. 115 (1988)， 79-88描述了从小鼠腹水一步纯化单克隆IgG抗体的方法。Raweerith， R.等人(J. Immun. Meth， 282 (2003) 63-72)使用方法的組合，即，辛酸沉淀法(caprylic acid precipitation)和离子交换层析的組合作 为分级分离胃蛋白酶消化的马抗蛇毒素F(ab')2抗体的方法。在WO 2003/102132中报导了用于纯化蛋白质的非亲和纯化步骤和高效切向流过 滤的组合。在WO 92/19973中报导了两种亲和层析步骤的组合。Follman， D. K.和Fahrner， R丄.报导了使用无A蛋白的三个层析步骤 的抗体纯化方法的析因篩选(factorial screening) (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85)。 Mhatre,R,等人(J. Chrom. A 707 (1995) 225-231) 4笨究了使用阳离 子交换层析和pH梯度洗脱对抗体Fab片段进行纯化。WO 94/00561 ^^导了人单克隆抗猕猴抗体和产生该抗体的细胞系。在 WO 2004/024866中报导了通过离子交换层析纯化多肽的方法，在所述方法 中，使用梯度洗涤从一种或多种污染物中分离出目的多肽。Schwarz，A.等 人(Laborpraxis 21 (1997) 62-66)报导了使用CM-HyperD-柱对单克隆抗 体的纯化。WO 2004/076485报导了使用A蛋白和离子交换层析进行抗体纯化的 方法。在EP 0 530 447中报导了通过组合三个层析步骤纯化IgG单克隆抗 体的方法。在US 4,983,722中报导了从抗体制品中除去A蛋白。WO 95/16037报导了通过A蛋白阳离子交换层析进行的从杂种杂交瘤 纯化抗EGF-R/抗-CD3双特异性单克隆抗体。在EP 1 084 136中报导了通 过使用离子交换层析从抗体多聚体分离其单体。US 5,429,746涉及^f吏用疏 水作用层析组合层析纯化抗体分子蛋白质。专利技术概述因此本专利技术的目的是提供用于纯化重组产生的免疫球蛋白和用于分离 单体和多聚体免疫球蛋白种类的另一种方法。本专利技术提供了用于纯化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括下列步骤a) 提供包含免疫球蛋白、緩冲物质和任选的盐的溶液；b) 在免疫球蛋白借以与弱离子交换材料结合的条件下，使溶液和该弱离子交换材料接触；c)通过使用包含緩冲物质和盐的溶液，以单步骤从弱离子交换材料回 收免疫球蛋白。本专利技术还提供了用于确定在单步骤纯化方法中从离子交换层析材料洗 脱多肽的盐浓度的方法，其包括下列两个步骤a) 步骤l包括下列亚步骤al)提供包含多肽、緩冲物质和任选的盐的溶液；a2)在多肽借以与离子交换材料结合的条件下，使包含该多肽的溶液 的第1等分试样与该离子交换材料接触；a3)通过使用包含緩冲物质和盐的溶液从离子交换材料回收多肽，其 中所述盐的浓度线性增加；a4)确定当多肽的第l级分开始从离子交换柱上洗脱时盐的起始浓度；b) 步骤2包括下列亚步骤bl)在多肽借以与离子交换材料结合的条件下，使包含该多肽的溶液 的第2等分试样与该离子交换材料接触；b2)通过使用三步洗脱方法从离子交换材料回收多肽，其中i) 将第1洗脱步骤的盐浓度计算为下列的总和步骤a4)中确定的起始盐浓度与该盐分子式中指示的非氢单价阳离子 总数的乘积，以及緩冲盐浓度与该緩冲盐分子式中指示的非氢单价阳离子总数的乘积；ii) 第2洗脱步骤的盐浓度是第1洗脱步骤的盐浓度与1.25和1.35之 间的因子的乘积；iii) 第3洗脱步骤的盐浓度是第1洗脱步骤的盐浓度与1.50和1.70之 间的因子的乘积；其中如下确定步骤ii)和iii)的因子当10mM和40mM之间的起始浓 度时，因子分别为1.35和1.70，当40mM和70mM之间的起始浓度时， 因子分别是1.30和1.60，以及当超过70 mM的起始浓度时，因子分别是 1.25和1.50。b3)确定多肽从离子交换柱洗脱时处于步骤b2)的三步骤洗脱法中的 哪个亚步骤，从而确定单步骤纯化法中用于从离子交换层析材料洗脱多肽 的盐浓度。专利技术详述按照下列定义在本申请中使用这些术语本申请中所用的术语"离子交换树脂"或"离子交换材料"是指携带共价 结合带电荷的取代基的固定高分子量基质。为了获得总体电中性，将非共 价结合的平衡离子结合至其上。"离子交换材料"具有将其非共价结合的平 衡离子与周围溶液的带相似电荷的离子交换的能力。根据其可交换的平衡 离子的电荷，"离子交换树脂"被称为阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。 根据带电荷基团(取代基)的性质，"离子交换树脂"例如在阳离子交换树脂 的情况下是指磺酸树脂(S)或羧甲基树脂(CM)。根据带电基团/取代基的化 学性质，可将"离子交换树脂，，另外分类为强或弱离子交换树脂，这取决于 于共价结合的带电荷的取代基的强度。例如，强阳离子交换树脂具有磺酸 基团作为带电荷的取代基，弱阳离子交换树脂具有J^&基团(优选羧甲基基 团)作为带电荷的取代基，并且弱阴离子交换树脂具有二乙氛乙基基团作为 带电荷的取代基。可以以不同的名称从许多公司获得阳离子交换树脂，例如Bio-Rex、 Macro-Prep CM (可从Biorad Laboratories, Hercules, CA，美国获才寻)、弱 阳离子交换剂WCX 2 (可从Ciphergen， Fremont, CA，美国获得)、Dowex本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于纯化免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括：　　　　ａ）提供包含免疫球蛋白、缓冲物质和任选的盐的溶液；　　　　ｂ）在免疫球蛋白借以与弱离子交换材料结合的条件下，使溶液与所述弱离子交换材料接触；　　　　ｃ）通过使用包含缓冲物质和盐的溶液，以单步骤从弱离子交换材料回收免疫球蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R法尔肯施泰因，B科尔布，M西博尔德，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]