通过转基因啮齿类动物制备人源化驼类单域抗体的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过转基因啮齿类动物制备人源化单域抗体的方法。所述方法通过构建人源化羊驼单域抗体人工染色体，制备转基因小鼠，同时采用同源重组的方法敲除小鼠内源性的抗体IgH、IgKappa和IgLamda基因簇，获得只表达人源化羊驼单域抗体的转基因小鼠，并用于制备人源化的单克隆羊驼单域抗体。可以通过杂交瘤或者单细胞PCR筛选的方法直接获得人源化的单域抗体，无需对获得的单域抗体进行体外突变和人源化改造，不需建库筛选，具有简单方便、安全性好的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种利用转基因啮齿类动物制备人源化单克隆驼类单域抗体的技术，属于分子生物学和免疫学领域。
技术介绍
在高等脊椎动物中，免疫球蛋白分子(Ig)通常被认为是由两条轻链(Lightchain,L)和两条重链(Heavychain,H)组成的蛋白四聚体(H2L2)。1993年在哺乳类骆驼科动物(Camelidae)的体液免疫系统中发现其免疫球蛋白IgG有两类结构：一类是IgG1，为重链和轻链的异型四聚体(eterotetramer)，相对分子质量约150kDa；另一类是在血清IgG中占50％左右的，相对分子质量约92kDa的IgG2和约90kDa的IgG3，均为重链的同型二聚体(homo-dimericheavy-chain)。这种天然缺失轻链的抗体，又被称为重链抗体(heavy-chainantibodies,HCAb)，存在于偶蹄目骆驼科的动物血液中。不同种类的骆驼科动物其HCAb单体的相对分子质量不尽相同，约为43～47kDa，比IgG1的重链单体小约10kDa。1995年以后，又相继在护士鲨(Ginglymostomacirratum)、斑纹须鲨(Orectolobusmaculatus)、银鲛、鳐等软骨鱼中发现了无轻链或其他蛋白分子伴随的类似于HCAb的抗体分子。通过基因工程技术可以获得保留抗原结合活性的HCAb的重链可变区，也称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb)。>骆驼科的动物包括双峰驼、单峰驼、驼马、原驼、大羊驼和小羊驼6种动物。一般哺乳动物血液中的抗体分子是由2条重链和2条轻链组成的4聚体蛋白分子，重链分为可变区(VH)和恒定区(CH)两部分。其恒定区又可以划分为CH1、CH2和CH3等三个区域。由于基因突变的原因，骆驼科的抗体重链基因组的可变区还存在一种VHH序列，短于正常的VH序列。在正常的抗体形成过程中，骆驼类抗体的重链VH区分别与D区、J区和CH1、CH2和CH3发生重排，形成正常的抗体重链多肽，然后与抗体轻链多肽形成常规的四聚体抗体分子。而VHH序列则与D区、J区和CH2、CH3发生重排，形成没有CH1序列的重链多肽，然后在没有轻链多肽的情况下，可以形成二聚体单域抗体分子。在H链CH1外显子/内含子交接部位存在一个终止密码和一个移码突变，阻止了功能性CH1的翻译；CH1外显子3'侧的GT二核苷酸基序转换成了AT基序，使拼接共识信号(spliceconsensussignal)缺失，造成3'端裂解失活，CH1外显子不能与铰链区外显子拼接，最终导致重链可变区与铰链区之间的CH1缺失。在切除恒定区后，可以获得2个具有抗原特异性结合的单链多肽序列，分子量只有15kd，长度为4nm，宽度为2.5nm，因此被称为纳米抗体。由于分子量低，免疫原性低，可以透过血脑屏障，也可以被肾脏快速代谢，因此纳米抗体在诊断和治疗领域具有广泛的应用，已经成为抗体药物研究的一个热点。Ablynx、Domantis和Genmab等一些生物制药技术公司为实现重组小分子抗体易筛选、易生产的目标，称之为纳米抗体(nanobody,Nb)、域抗体(domainantibody,dAb)或单抗体(unibody)，并加大投入，促使这类候选小型化抗体加速进入临床前研发阶段，为药物研发与治疗创造便利。由于在骆驼科动物的血液中即存在普通的四聚体抗体，也存在二聚体的单域抗体，因此，不能通过从血清中纯化的方法获得高纯度的单域抗体，也不能应用杂交瘤技术或者单细胞PCR的方法制备单克隆羊驼单域抗体。现在羊驼单域抗体的制备是通过抗原直接免疫羊驼的方法，然后抽取免疫后羊驼的血液，分离白细胞后提取mRNA，反转录后建立单域抗体噬菌体表面展示文库，然后采用抗原筛选文库获得单域抗体的DNA序列，可以在工程细胞，如大肠杆菌和CHO细胞中表达单域抗体或者纳米抗体，抗原的使用量大，成本高，还需要对获得的单域抗体进行人源化改造。虽然纳米抗体的分子量小，免疫原性低，但是用于人体的话也可能产生不必要的免疫反应，因此需要对纳米抗体进行人源化改造。这样不仅可能降低抗体的亲和力，也可能会引入新的免疫原性，工作量也大。抗体分子与抗原分子的特异结合是通过抗体分子的可变区完成的，普通抗体分子的重链和轻链多肽都有可变区序列，每个重链可变区和轻链可变区共同形成一个抗原结合位点，因此一个常规的抗体分子具有2个抗原结合区。重链或者轻链可变区内氨基酸序列的多样性，是抗体分子结合不同抗原分子的分子基础。但是在可变区内还可以划分为抗原结合区(CDR区)和框架区(FR区)，抗体分子是通过CDR区结合抗原分子，框架区则提供可变区的空间结构框架，氨基酸序列是保守的。因此理论上，保留CDR区的氨基酸序列以维持抗体分子的抗原结合活性，可以采用人的框架区序列替换异源动物抗体的框架区，从而实现抗体的人源化改造。但是在抗体基因的重排和突变过程中，框架区的氨基酸序列对CDR区的结构也有一定的影响，因此如果在体外进行人源化改造，很可能改变抗体分子的空间结构，并对抗体分子的抗原结合活性造成影响。因此，基于现有技术存在的问题，本专利技术意在提供一种操作简便、省却体外的突变和筛选步骤、生产方便，并且具有较好的人源化程度的单域抗体生制备方法。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种通过转基因啮齿类动物制备人源化羊驼IgG单域抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有人源化IgG抗体VHH区编码序列串联结构的细菌人工染色体DNA；(2)将步骤(1)获得的细菌人工染色体DNA转导入啮齿类动物受精卵雄性原核内；(3)将步骤(2)获得的受精卵移入假孕雌性啮齿类动物身体两侧的输卵管内，使胚胎在代孕母体内发育，经一个完整的发育周期产下子代；(4)鉴定出含有人源化单域抗体基因座的转基因啮齿类动物；(5)将鉴定出的转基因啮齿类动物与采用同源重组方法敲除内源性抗体重链IgH、轻链IgKappa和IgLamda的啮齿类动物杂交，最终获得含有人源化单域抗体基因座，同时内源性抗体重链IgH、轻链IgKappa和IgLamda基因被敲除的人源化单域抗体转基因啮齿类动物；(6)从步骤(5)获得的人源化单域抗体转基因啮齿类动物中获得单克隆单域纳米抗体。在一个优选的技术方案中，所述啮齿类动物为小鼠。步骤(6)中，可通过采用目的抗原免疫转基因小鼠后通过常规的杂交瘤技术，或者构建单域本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过转基因啮齿类动物制备人源化IgG单域抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有人源化IgG抗体VHH区编码序列串联结构的细菌人工染色体DNA；(2)将步骤(1)获得的细菌人工染色体DNA转导入啮齿类动物受精卵雄性原核内；(3)将步骤(2)获得的受精卵移入假孕雌性啮齿类动物身体两侧的输卵管内，使胚胎在代孕母体内发育，经一个完整的发育周期产下子代；(4)鉴定出含有人源化单域抗体基因座的转基因啮齿类动物；(5)将鉴定出的转基因啮齿类动物与采用同源重组方法敲除内源性抗体重链IgH、轻链IgKappa和IgLamda的啮齿类动物杂交，最终获得含有人源化单域抗体基因座，同时内源性抗体重链IgH、轻链IgKappa和IgLamda基因被敲除的人源化单域抗体转基因啮齿类动物；(6)从步骤(5)获得的人源化单域抗体转基因啮齿类动物中获得单克隆单域纳米抗体。

【技术特征摘要】
1.一种通过转基因啮齿类动物制备人源化IgG单域抗体的方法，所
述方法包括以下步骤：
(1)构建含有人源化IgG抗体VHH区编码序列串联结构的细菌人工
染色体DNA；
(2)将步骤(1)获得的细菌人工染色体DNA转导入啮齿类动物受
精卵雄性原核内；
(3)将步骤(2)获得的受精卵移入假孕雌性啮齿类动物身体两侧的
输卵管内，使胚胎在代孕母体内发育，经一个完整的发育周期产下子代；
(4)鉴定出含有人源化单域抗体基因座的转基因啮齿类动物；
(5)将鉴定出的转基因啮齿类动物与采用同源重组方法敲除内源性
抗体重链IgH、轻链IgKappa和IgLamda的啮齿类动物杂交，最终获得含
有人源化单域抗体基因座，同时内源性抗体重链IgH、轻链IgKappa和
IgLamda基因被敲除的人源化单域抗体转基因啮齿类动物；
(6)从步骤(5)获得的人源化单域抗体转基因啮齿类动物中获得单
克隆单域纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物为小
鼠。
3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，李敏，王庆东，
申请(专利权)人：长春力太生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22