一种新型ProteinA及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了种新型ProteinA及其制备方法和用途。本发明专利技术提供的ProteinA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提供的葡萄球菌蛋白A制备的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率大大改善的优点，更有利于蛋白质的分离纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种ProteinA及其制备方法和用途。
技术介绍
ProteinA，也称葡萄球菌蛋白A(StaphylococalProteinA，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年，Jensen也发现了类似现象，将其命名为A抗原；1960年Grov将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A，1963年Lofkvist等分离了A抗原，并证明它是一种蛋白质，且与糖有区别。ProteinA因其能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段，能与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，常被用做蛋白纯化的亲和填料。随着生物技术产业，特别是以单克隆抗体药物为代表的生物制药产业的快速发展，葡萄球菌蛋白A的市场需求迅速增加，且对ProteinA亲和柱的亲和力、纯化效率等要求越来越高，现有的ProteinA亲和柱不能完全满足要求，因此，开发一种具有更高亲和力的ProteinA仍是目前所急需的。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人经过大量的研究，开发了一种新型的ProteinA，其具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，其与现有的ProteinA相比具有更高的蛋白亲和力。具体地，本专利技术提供了：1、一种葡萄球菌蛋白A，其特征在于，所述葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2、编码如上述1所述的葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3、一种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体含有上述2所述的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。4、如上述3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体可选自pCHO1.0、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR和pET32a。5、一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转化有上述4所述的表达载体。6、如上述5所述的宿主细胞，其特征在于，所述及的宿主细胞是BL21DE3。7、如上述1所述的葡萄球菌蛋白A用于抗体检测、分离、纯化的应用。8、一种亲和层析介质，其特征在于，所述亲和层析介质包含上述1所述的葡萄球菌蛋白A和层析介质载体。9、如上述8所述的亲和层析介质，其特征为，所述层析介质载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。10、如上述9所述的亲和层析介质，其特征为，所述层析介质载体是琼脂糖凝胶。本专利技术重组葡萄球菌蛋白A的基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，5‘端由Ala-Asp突变成Val-Asp，以形成AccI酶切位点(GTAGAC)，各重组蛋白A基因单体间以AccI酶切位点相连，其中第一个重组蛋白A基因单体前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)和EK酶切位点(将His和DDDDK切去)，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入中止密码子TAA和及克隆用BamHI限制性内切酶接头。该基因由561个核苷酸构成。本专利技术重组葡萄球菌蛋白A基因序列如SEQIDNo.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供的ProteinA制备的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率大大改善的优点，与市售的ProteinASepharose4FastFlow相比，其动态吸附载量明显提高。具体实施方式以下结合实施例进一步说明本专利技术，下述实施例不应理解为对本专利技术的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais,T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual,2ndedition,ColdspringHarborLaboratoryPress.实施例1葡萄球菌蛋白A基因单体制备通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白A基因一个重复片段(重复片段序列如SEQIDNO:2所示的第46-210位核苷酸所示)的序列单体，其包括长度为165bp的重复片段，以及前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点、6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)、EK酶切位点(用于将His和DDDDK切去，形成正确的ProteinA)和AccI酶切位点(gtagac，用于连入多个重复片段)。另外，还包括终止密码子TAA，及克隆用BamHI限制性内切酶接头共9bp。标记为“单体1”。另外，通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白A基因一个重复片段(重复片段序列如SEQIDNO:2的第46-210位核苷酸所示)的序列单体，其序列包括长度为165bp重复片段，以及两端AccI酶切位点。标记为“单体2”。实施例2、构建含一个葡萄球菌蛋白A基因单体的pET32a载体用限制型内切酶NcoI和BamHI酶切实施例1所获得的单体1，然后与经NcoI及BamHI酶切的载体pET32a连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明葡萄球菌蛋白A基因单体已克隆至pET32a中，从而成功构建含一个葡萄球菌蛋白A基因单体的pET32a载体。实施例3、含有葡萄球菌蛋白A基因的pET32a-P载体的构建将上述实施例1所获得的单体2以AccI酶切，回收相应片段，然后与上述实施例2所构建的含一个葡萄球菌蛋白A基因单体的pET32a载体连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有3个蛋白A基因单体的葡萄球菌蛋白A的载体，标记为“pET32a-P”，经检测，其基因序列如SEQIDNo：2所示。实施例4、表达葡萄球菌蛋白A的大肠杆菌菌株的构建用CaCl2法将上述实施例3所获得的pET32a-P转化BL21DE3，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET32a-P的重组转化子，标志为“BL21DE3-pET32a-P”。实施例5、生产葡萄球菌蛋白A步骤1：菌种的培养发酵挑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄球菌蛋白A，其特征在于，所述葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄球菌蛋白A，其特征在于，所述葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列
如SEQIDNO：1所示。
2.编码如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列，其特征在于，
所述核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的
核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体可选自pCHO1.0、
pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR和pET32a。
5.一种宿主细胞，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎健荣，张彦，路玲玉，胡湘丽，
申请(专利权)人：上海抗体药物国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31