表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用。该构建表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Ｆｃ片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的５′末端连接有编码信号肽核苷酸序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。本发明专利技术利用所述表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌制备抗体及抗体类似物，既可以解决生产抗体比较困难、要求产品纯度高、数量大等瓶颈，又可以发挥抗体Ｆｃ段提供的功能，因而具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用。
技术介绍
基因工程抗体和抗体类似物药物是近年来发展最快的药物之一。这类药物往往人 用剂量较大， 一剂达数十至数百毫克， 一名病人一个疗程常需要克级量的抗体药物，因此其 市场需求量巨大。抗体药物是一类结构复杂的蛋白，它的单体是对称性的分子， 一个重链和 一个轻链以一个分子间二硫键和非共价键结合在一起，两个重链又靠非共价键及一个或多 个二硫键连接在一起形成抗体单体。有些抗体分子由一个单体组成，如IgG，有些抗体可以 由多个单体连接起来形成多聚体，如IgM可为五聚体，IgA可为二聚体。因此用基因工程方 法表达抗体时，需要同时表达抗体的轻链和重链两条肽链，轻重链在细胞内组装成完整的 抗体分子，再分泌到胞外。抗体类似物，是由抗体重链的Fc部分与其它蛋白融合获得的，它 们也能通过Fc部分的分子间二硫键形成类似抗体的结构。由于抗体蛋白结构的复杂性，基 因工程抗体药物大多由哺乳动物细胞生产。虽然，近年来哺乳动物细胞的表达水平已有较 大的提高，但哺乳动物细胞高昂的培养成本，及培养规模的限制依然严重制约着该类药物 的发展，也是导致抗体药物治疗价格昂贵的主要原因。 酵母作为最简单的真核生物，即具有培养成本低廉，易于规模生产，表达水平高， 又具有翻译后修饰功能，可以完成蛋白肽链的折叠和蛋白复合体的组装。近年来，酵母糖基 工程的发展，又使酵母具备了复杂型糖基合成能力。因而酵母有望成为抗体药物制备的廉 价平台。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与 应用。 本专利技术所提供的表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的构建方法是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5'末端连接有编码信号肽的序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。 所述血清白蛋白信号肽可为如下的1)或2): 1)其氨基酸序列为序列表中的序列1 ; 2)与序列表中序列1的同源性大于50%的多肽。 所述血清白蛋白信号肽具体可为序列表中的序列5或6或7。研究发现，酵母中 影响抗体表达水平的一个重要因素是抗体分泌能力的不足，尤其是重链的分泌是影响整 个抗体表达的重要因素，这种现象不仅在全抗体表达时存在，在抗体片段的表达中也发现 有类似现象(Gasser B， Maurer M， Gach J， et al. Engineering ofPichia pastoris forimproved production of antibody fragments. BiotechnolBioeng. 2006，94(2) :353-61)。 本专利技术所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5'末端连接有编码血清 白蛋白信号肽的核苷酸序列，从而提高抗体及抗体类似物表达水平，因而具有重要的应用 前景。不同动物来源的血清白蛋白信号肽序列上有一定的差异，如人血清白蛋白与非洲爪 蛙血清白蛋白信号肽序列同源性只有50%，但都有促进抗体分泌的作用，因此上述血清白 蛋白信号肽可以来源于各种动物，优选的是哺乳动物血清白蛋白信号肽，如人、牛等血清白 蛋白的信号肽。这些序列可以在许多公开数据库，如可以从公开的美国国立生物技术信息 中心NCBI (http:〃丽w. ncbi. nlm. nih. gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL (http: 〃丽w. embl.org)公开的数据库中获得，编码这些信号肽的DNA，可以采用PCR、酶切等方法从相 应物种的cDNA或其文库等获得，也可以采用人工合成的方法获得，这些DNA序列可以是天 然序列，也可以用同义密码子替换的序列，尤其是采用酵母偏爱密码子替换原密码子往往 有利于抗体的表达。上述血清白蛋白信号肽也可以是来源于各物种的血清白蛋白信号肽， 通过物种间重组、突变、缺失等获得的变异体。这些变异体是指与上述信号肽同源性大于 50% ，并具有促进抗体或抗体类似物分泌的多肽，较优的是同源性大于80% 、最优的是同源 性大于95%的多肽。这些变异体的构建可以采用定点突变、随机突变、致错PCR、 DNA重排 等本领域已知的各种方法。血清白蛋白信号肽编码序列可以与抗体的重链基因和/或轻链 基因融合，也可以与抗体类似物中Fc融合蛋白基因融合。也可以在信号肽编码序列与基因 之间加入接头序列。血清白蛋白信号肽与抗体的一个基因融合，即对抗体的分泌具有明显 的促进作用。 抗体由轻、重链两个基因编码，转录后的两条重链和两条轻链在细胞内组装成完 整的抗体单体分子。实现抗体高效表达可将两个基因分别置于同一启动子的下游，然后将 这两个含有不同基因的表达盒克隆在质粒上，转化酵母后同时表达两个基因。为了使这两 个基因在同一个酵母中同时协调表达，还可将两个基因分别置于不同启动子下游，从而明 显提高抗体的表达量。避免了由于存在两个相同的启动子，而引起的启动子间同源重组 而导致的基因不稳定。这些启动子可以是适合在酵母中使用的各种启动子，如醇氧化酶 (A0X) 、 FLD、甘油醛脱氢酶(GAP) 、 PMA、乳糖启动子(LAC) 、 ADH、乙醇氧化酶、PH05、 PGK等。 优选的是用两种具有相同诱导条件或均为组成型的启动子，如A0X与FLD，均可以用甲醇 诱导；GAP与PMA均为组成型启动子等，这些启动子的序列可以从各种文献和公开的数据 库，如从美国国立生物技术信息中心NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)或者欧洲分 子生物实验室EMBL (http :〃w丽.embl.org)公开的数据库中获得。根据这些序列，可以用 本领域周知的方法，如PCR、人工合成等方法获得这些基因，其中PCR所用模板，可以是各种 酵母的基因组DNA、或者含有这些启动子的商业化载体。如美国Invitrogen公司的质粒 pPIC9(含A0Xl启动子)、pGAP(含GAP启动子)等。用不同启动子控制抗体轻、重链表达 的载体的构建，可以用本领域共知的各种方法、如酶切连接、PCR等方法。载体上的其它元 件，如载体的复制区、筛选标记等可来源于各种商业化的载体，如PUC19 (上海生工公司)、 pPIC9 (美国Invitrogen公司)等。 抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成融合蛋白，所述融合蛋白通 过Fc上的二硫键形成类似抗体的二聚体结构的蛋白。构建抗体类似物时可以利用Fc段所 特有的生物学效应功能，将某些具有特异识别及结合功能的蛋白(如细胞膜受体)与抗体Fc段融合。 所述抗体的Fc片段选自如下任一抗体IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、 IgD和IgE。 编码上述信号肽的核酸序列与编码抗体重链、轻链或抗体类似物中Fc融合蛋白 基因，在保持各自编码氨基酸序列的阅读框不变的条件下融合(同框融合)，获得带有上述 信号肽的抗体或抗体类似物的编码基因。该基因插入合适的酵母表达载体获得抗体或抗体 类似物的表达载体。该载体转化酵母获得表达抗体或抗体类似物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Ｆｃ片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的５′末端连接有编码信号肽核苷酸序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。

【技术特征摘要】
构建表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5′末端连接有编码信号肽核苷酸序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述血清白蛋白信号肽为哺乳动物血清 白蛋白信号肽。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述血清白蛋白信号肽为如下的1) 或2):1) 其氨基酸序列为序列表中的序列1 ;2) 与序列表中序列1的同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘波，吴军，王凌雪，巩新，唱韶红，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]