一种确定样品中靶分子丰度的方法技术

一种确定液体样品中靶分子丰度的方法，包括以下步骤：在反应室中将液体样品与包含与荧光探针缀合的单域抗体的靶分子结合探针一起孵育以提供反应混合物，测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化，并且将偏振变化与样品中的靶分子的丰度相关联。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种确定样品中靶分子丰度的方法
技术介绍
免疫荧光是用于荧光显微镜的光学显微镜技术，主要用于微生物样品。该技术利用抗体对其抗原的特异性将荧光染料靶向细胞内的特定生物分子靶标，因此允许靶分子在样品中的分布可视化。免疫荧光是免疫染色的广泛使用的实例，并且是利用荧光团来显现抗体位置的免疫组织化学的具体实例。Nielsen等人描述了一种荧光偏振免疫测定法(Methods22,71-76,2000)，并且该测定法可以用于快速和精确检测抗体或抗原。所述测定法基于在溶液中小分子旋转比较大分子旋转更快的原理，并且旋转速率可以通过荧光偏振确定。当样品中的抗体与用荧光探针标记的抗体的特异性抗原一起孵育时，样品中抗体-抗原复合物的存在可以通过荧光偏振来检测。这种技术的难题在于，为了检测给定的抗体，需要针对给定的抗体的特异性抗原，这使得所述测定法对于许多公司来说是昂贵的。该技术的另一个难题是其不适用于定量检测样品中的抗体。MinChen等人(Foodadditives&Contaminants:partA,vol.31(12),pp.1959-1967(2014))描述了一种方法试剂盒和缀合物，其用于通过在反应容器中使牛奶与双特异性单链抗体和FITC标记的靶分子反应并将竞争反应物与靶分子的量相关联来确定牛奶中抗生素丰度。GiridharaGokulrangan等人(AnalyticalChemistry,vol.77(1),pp.17-32(2011))描述了一种通过荧光偏振确定靶抗体丰度的方法，其中靶抗体结合探针是与荧光团连接的适配体。本专利技术的目的是克服至少一个上述问题。
技术实现思路
本专利技术基于如下发现：样品中靶分子的存在或丰度可以使用荧光偏振和包含与单域抗体缀合的荧光染料的示踪剂来确定，其中单域抗体的小尺寸允许使用荧光偏振格式高度灵敏地量化样品中的靶分子。在第一方面，本专利技术提供了用于确定液体样品中靶分子的存在或丰度的方法，其包括以下步骤：-在反应室中将液体样品与包含与荧光探针缀合的单域抗体的靶分子结合探针一起孵育以提供反应混合物，其中单链抗体能够选择性地结合靶分子；-测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和-将偏振变化与样品中靶分子的存在或丰度相关联。在一个实施例中，靶分子是或包含聚氨基酸，比如蛋白质、多肽或肽。在一个实施例中，靶蛋白是靶抗体。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的恒定区。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的可变区。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合靶抗体的互补位。在一个实施例中，单链抗体能够选择性结合抗体的特定同种型(specificisotype)(即能够结合样品中的所有IgE抗体)。在一个实施例中，靶抗体是IgE抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgG抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgM抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgA抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgA抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgY抗体。在一个实施例中，靶抗体是IgW抗体。在一个实施例中，靶分子是抗原。在一个实施例中，抗原是微生物特异性抗原。在一个实施例中，抗原是疾病特异性抗原。在一个实施例中，抗原是细胞特异性抗原。在一个实施例中，抗原是表型特异性抗原。在一个实施例中，靶分子是或包含靶寡糖。在一个实施例中，靶分子是或包含靶核酸。在一个实施例中，靶分子由细胞表达。在一个实施例中，反应混合物包含细胞培养物，其中细胞培养物表达靶分子。在一个实施例中，细胞培养物包含产生单克隆抗体的细胞，并且其中单克隆抗体是靶分子。在一个实施例中，细胞是真核或原核生产细胞(producercell)。优选地，反应室是多层板的孔。优选地，荧光探针是长寿命荧光探针。在一个实施例中，所述方法是用于确定液体样品中靶分子丰度的快速方法。在一个实施例中，所述方法是用于确定液体样品中靶分子丰度的高通量方法。在一个实施例中，多个细胞培养物样品包含一组克隆生产细胞。因此，本专利技术还涉及快速、高通量的测定克隆生产细胞组中抗体滴度的方法，其中抗体是靶分子。通常，方法使用荧光偏振分析仪，该荧光偏振分析仪能够同时在微量滴定板的多个孔上进行荧光偏振测定。本专利技术还提供单域抗体和荧光探针的缀合物。在一个实施例中，荧光探针是长寿命荧光探针。在一个实施例中，荧光探针是FITC。本专利技术还提供了通常适用于实施本专利技术方法的试剂盒，其包含(a)包含缀合至荧光探针的单域抗体的靶分子结合探针和(b)荧光偏振分析仪。在一个实施例中，探针包含具有至少3ns的荧光寿命的荧光探针。在一个实施例中，荧光偏振分析器配置为同时检测微量滴定板的多个孔中的荧光偏振的变化。附图简述参照附图，从以下仅作为示例给出的实施例的描述中将更能清楚地理解本专利技术，其中：图1是显示检测IgE的纳米抗体结合的图，其中将0.005mg/L的标记的纳米抗体的PBS/BSA溶液加入到人IgE中。测量每个浓度的偏振信号。图2：显示无IgG的纳米抗体结合的检测的图，其中将0.005mg/L的标记的纳米抗体的PBS/BSA溶液加入到人IgG中。测量每个浓度的偏振信号。具体实施方式“靶分子结合探针”是指单域抗体和荧光探针的缀合物，其中在缀合状态下，单域抗体能够选择性结合靶分子，并且其中荧光探针能够在激发后再发光。缀合可以通过使用例如可切割或不可切割的稳定接头的共价键来实现。将抗体(包括单域抗体和单链抗体)联结到分开的实体的具体方法对于本领域技术人员是公知的，并且描述于例如：Chakravartyetal.，Theranostics2014；4(4)：386-398；ADCReview/JournalofAntibody-drugConjugates：StableLinker(technologies)，May23，2013；MethodsMolBiol.2013；1045：1-27.doi：10.1007/978-1-62703-541-5_1；″Cellkillingbyantibody-drugconjugates″.Cancerletters255(2)：232-40.doi：10.1016/j.canlet.2007.04.010.PMID17553616；″NewnethodofpeptidecleavagebasedonEdmandegradation″.Moleculardiversity17(3)：605-11.doi：10.1007/s11030-013-9453-y.PMC3713267.PMID23690169；″Synthesisofsite-specificantibody-drugconjugatesusingunnaturalaminoacids″.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences109(40)：16101-6.doi：10.1073/pnas.1211023109.PMC3479532.PMID22988081；“Currentmethodsforthesynthesisofhomogenousantibody-drugconjugates”BiotechnologyAdvances(33)Issue6，Part1(se本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定液体样品中靶分子丰度的方法，包括以下步骤：‑在反应室中将液体样品与靶分子结合探针一起孵育以提供反应混合物，所述靶分子结合探针包含与荧光探针缀合的单域抗体，其中单链抗体能够选择性结合所述靶分子；‑测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和‑将偏振变化与样品中靶分子的丰度相关联。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.18 EP 15201419.71.一种确定液体样品中靶分子丰度的方法，包括以下步骤：-在反应室中将液体样品与靶分子结合探针一起孵育以提供反应混合物，所述靶分子结合探针包含与荧光探针缀合的单域抗体，其中单链抗体能够选择性结合所述靶分子；-测定反应室中的反应混合物的荧光偏振以检测激发光和发射光之间的偏振变化；和-将偏振变化与样品中靶分子的丰度相关联。2.如权利要求1所述的方法，其中荧光探针具有至少4ns的寿命。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单域抗体能够特异性结合靶抗体的高变区。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单域抗体能够特异性结合靶抗体的恒定区。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其是同时确定多个液体样品中至少一种靶分子的丰度的快速、高通量的方法，其中将每个液体样品单独孵育在微量滴定板的孔中。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：J·克利福德，B·汤普森，
申请(专利权)人：瓦里泰细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰,IE