本发明专利技术公开了一种血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法，采用甲醇提取，待样品冻干后进行两步衍生用于气相色谱-三重四级杆质谱联用仪分析。采用多反应监测模式进行检测，对于低含量的代谢物，优化得到丰度最佳的离子对作为定量离子对，提高灵敏度；而对于高含量的代谢物，优化后选取丰度低的离子对作为定量离子对，以拓宽其线性范围，以实现高、低丰度代谢物的同时分析。本发明专利技术的分析方法具有前处理简单、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等优点。
【技术实现步骤摘要】
血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法
本专利技术涉及分析化学领域和生物化学领域，是一种基于气相色谱-三重四级杆质谱联用多反应监测模式进行血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物分析的方法。
技术介绍
葡萄糖是糖在血液中的运输形式，在机体糖代谢中占据主要地位，是维持生命活动的重要物质。葡萄糖通过糖酵解转变为丙酮酸并产生能量，丙酮酸在有氧条件下经过三羧酸循环和氧化磷酸化彻底氧化形成CO2和H2O，产生大量自由能；而在无氧条件下则转化为乳酸。葡萄糖经糖酵解到彻底氧化不仅为机体提供大量自由能，而且为一些物质合成提供前体物质，其代谢异常与癌症、心血管疾病、代谢综合征、糖尿病等多种疾病密切相关。因此建立简单、稳健、高灵敏的葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法将为与其代谢相关的生理和病理研究提供帮助。葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物在血中浓度差异非常大，根据HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/)中给出的浓度含量范围，相关代谢物的浓度最大相差4个数量级，对其分析造成了很大困难。近年来出现多种技术用于葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析。Luo等报道了基于液质联用的靶向分析方法，但存在灵敏度及覆盖度等问题；Ye等报道了基于气质联用的拟靶向方法，存在覆盖度的问题。在定量分析方面，通常对葡萄糖和三羧酸循环中间产物进行分别分析。葡萄糖的测定主要有酶法、电化学法、光化学法等；三羧酸循环中间产物的定量分析多用气质联用的方法，如Calderón-Santiago等采用氯仿甲醇水双相提取，选择离子扫描模式检测，但存在提取复杂、溶剂毒性大等问题。气相色谱-三重四级杆质谱联用技术，作为靶向分析强有力的工具，通过气相色谱分离结合两级质谱的选择离子扫描，最大限度地排除基质干扰，具有灵敏度高、线性范围宽等优点；且尚未见基于气相色谱-三重四级杆质谱联用多反应监测模式分析葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的相关报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有方法的不足，建立了气相色谱-三重四级杆质谱联用多反应监测模式进行葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法,可一次进样分析得到血清中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的含量，用于相关疾病代谢的研究，为了解机体的生理过程及疾病的发生发展机制等提供依据。该方法具有前处理简单、灵敏度高、重复性好、线性范围宽等优点。本专利技术采用的技术路线如下：(1)将-80℃保存的血清样本解冻，涡旋10s，准确移取50μL，加入含内标的甲醇溶液200μL，涡旋1min。甲醇溶液中内标浓度分别为：乳酸-3,3,3-d3(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d4(0.2μg/mL)，富马酸-2,3-d2(0.1μg/mL)，柠檬酸-2,2,4,4-d4(5μg/mL)，葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7(150μg/mL)。4℃下14000rpm离心15min，取200μL上清溶液冷冻干燥。(2)于冻干血清样本中加入50μL甲氧胺溶液(20mg.ml，吡啶)，涡旋30s，超声1min，37℃水浴中反应1.5h；待反应结束，加入40μLN-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋10s，37℃水浴中反应1h；反应完成后，4℃下14000rpm离心10min，取上清溶液用于分析。(3)气相色谱-三重四级杆质谱联用仪器用于样本分析。气相色谱条件：HP-5MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm,AgilentTechnologies,USA)。柱温采用程序升温，70℃保持1min，5℃/min升至190℃，15℃/min升至310℃，后平衡5min。进样口温度300℃，进样体积1μL，分流比1:5。氦气(99.9995％,China)作为载气，流速1.2mL/min，恒流模式；质谱条件：EI源，-70eV，传输线和离子源温度分别是280℃和230℃。溶剂延迟时间5.5min。碰撞气为氮气，流速1.5mL/min；淬灭气为氦气，流速为2.25mL/min。采用多反应监测模式检测，对于低含量代谢物，选择丰度高的母离子，对其进行子离子扫描并优化碰撞能，选择S/N最大且特异性好的离子对作为定量离子对，并辅以定性离子对；对于高含量代谢物(乳酸、葡萄糖)，选择丰度低的母离子，子离子扫描并优化碰撞能，选择低丰度的离子对作为定量离子对，并辅以定性离子对。附表1为优化后得到的代谢物定量离子对、定性离子对，及其相应的碰撞能信息。(4)质谱数据用MasshunterQuantitativeAnalysisSoftware导出，采用内标法对代谢物进行定量分析。本方法采用甲醇一步提取，相对于氯仿甲醇水双相提取，该方法操作简单、重复性好、且溶剂毒性小；并采用气相色谱-三重四级杆质谱多反应监测模式进行检测，抗干扰能力强、灵敏度高，对于低含量代谢物检测限在0.17-2.13ng/mL；通过离子对选择及碰撞能优化，可以实现高低含量代谢物同时检测分析。附图说明图1为正常人血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物和内标的总离子流图。图2为正常人血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物和内标的定量离子对提取流图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的实施例作详细说明：实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例一基于气相色谱-三重四级杆质谱联用检测血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物方法的评价参考HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/)，如不同年龄人群血糖含量范围在1100-16440μM，即198.2-2961.8μg/mL。根据数据库中代谢物的参考浓度范围配制混标溶液，浓度分别为丙酮酸(800.0μg/mL)，乳酸(4000μg/mL)，琥珀酸(800.0μg/mL)，富马酸(800.0μg/mL)，苹果酸(800.0μg/mL)，2-羟基戊二酸(800.0μg/mL)，2-酮戊二酸(800.0μg/mL)，乌头酸(800.0μg/mL)，柠檬酸(800.0μg/mL)，异柠檬酸(800.0μg/mL)，葡萄糖(4000μg/mL)，用纯水将混标溶液分别稀释1.33倍、1.6倍、2.67倍、4倍、8倍、40倍、80倍、400倍、800倍、4000倍、8000倍、20000倍、40000倍、100000倍、200000倍、500000倍、1000000倍、2500000倍得到不同浓度的混标溶液。取不同浓度的混标溶液各50μL，分别加入200μL含内标的甲醇溶液，涡旋1min；甲醇溶液中内标浓度分别为：乳酸-3,3,3-d3(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d4(0.2μg/mL)，富马酸-2,3-d2(0.1μg/mL)，柠檬酸-2,2,4,4-d4(5μg/mL)，葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7(150μg/mL)。4℃下14000rpm离心15min，取200μL上清溶液冷冻干燥。于冻干样本中加入50μL甲氧胺溶液(20mg/ml吡啶)，涡旋30s，超声1min，37℃水浴中反应1.5h；待反应结束，加入40μLN-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋10s，37℃水浴中反本文档来自技高网...
【技术保护点】
血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)在血清样本加入含内标的提取溶液，涡旋混匀，然后离心，定量移取上清溶液，并置于冻干机中冷冻干燥；(2)于冻干后的样本中加入甲氧胺溶液，待代谢物溶解并混匀，水浴加热进行肟化反应；再加入N‑甲基‑N‑(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋混匀，水浴加热进行硅烷化反应；待反应结束后，低温高速离心，取上清溶液用于分析；(3)采用气相色谱‑三重四级杆质谱联用的多反应监测模式进行样本分析；(4)采用内标法对代谢物进行定量分析。
【技术特征摘要】
1.血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)在血清样本加入含内标的提取溶液，涡旋混匀，然后离心，定量移取上清溶液，并置于冻干机中冷冻干燥；(2)于冻干后的样本中加入甲氧胺溶液，待代谢物溶解并混匀，水浴加热进行肟化反应；再加入N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋混匀，水浴加热进行硅烷化反应；待反应结束后，低温高速离心，取上清溶液用于分析；(3)采用气相色谱-三重四级杆质谱联用的多反应监测模式进行样本分析；(4)采用内标法对代谢物进行定量分析。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(1)定量移取20-200μL血清样本，加入含内标的甲醇溶液80-800μL，涡旋0.5-2min；甲醇溶液中内标浓度分别为：乳酸-3,3,3-d3(50-250μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d4(0.1-2.0μg/mL)，富马酸-2,3-d2(0.1-2.0μg/mL)，柠檬酸-2,2,4,4-d4(1.0-10μg/mL)，葡萄糖-13C6,1,2,3,4,5,6,6-d7(100-500μg/mL)；4-25℃下12000-14000rpm离心10-20min，取80-800μL上清溶液冷冻干燥。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中于冻干样本中加入20-200μL甲氧胺溶液(20mg/mL吡啶)，涡旋30-120s，超声1-15min，37-40℃水浴中反应1.5-2h；待反应结束，加入16-160μLN-甲基-N-...
【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，周洋，路鑫，张俊杰，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。