一种预测细胞表型不稳定性的方法技术

一种预测细胞系表型稳定性的方法，包括步骤：在测定期培养细胞系，以及在测定期的多个不同时间点产生细胞系的环境响应指纹，其中每个环境响应指纹通过在多种化学细胞应激源存在时测定细胞的环境响应产生。比较多个环境响应指纹以检测测定期所述环境响应指纹的改变。在测定期所述环境响应指纹的改变程度指示所述细胞系中预测的表型不稳定性程度。该环境响应可以是生长响应、产量响应或者其它可检测的环境响应。

A method for predicting cell phenotypic instability

A prediction method, cell phenotypic stability includes the steps of: in the determination of training cell line, and cell lines at different time points were determined during the environmental response of fingerprints, each environmental response fingerprint by measuring cell in the presence of a variety of chemical stress cells source environment response. A plurality of environmental response fingerprints are used to detect changes in the environmental response fingerprints during the determination period. In the measurement period, the degree of change in environmental response fingerprints indicates the degree of phenotypic instability predicted in the cell line. The environmental response can be growth response, yield response, or other detectable environmental response.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】简介本专利技术涉及一种预测细胞(通常是哺乳动物生产细胞)表型不稳定性的方法。专利技术背景从调控的角度来看稳定性的主要方面仅指产物，即该产物一致的特性(例如一致的糖型和更普遍的体内活性)。但是，从生产的角度来看，稳定性的重要方面理所当然的是产物的质量，还有生产克隆细胞系的一致生长和产率。例如，根据LonzaTM指南，倍增数超过40(大约10次传代)产物滴定度的变化超过30％则被认为是不稳定的细胞系。该细胞系的改变可以归因于基因复制数目、mRNA复制数目的改变，以及整个细胞潜在的改变(即蛋白质组和代谢组的改变)。细胞基因组的改变表明一定程度的表型基因的不稳定或者“突变表型”(Loeb等，1999)。任何已经变成这种表型的克隆细胞系很有可能会出现表型中其它相关改变。本专利技术的目的是至少解决一个上文提及的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种预测细胞系表型稳定性的方法，包括以下步骤：-在测定期培养所述细胞系；-在测定期的多个不同时间点产生细胞系的环境响应指纹，其中每个环境响应指纹通过在多种化学细胞应激源存在时测定细胞的环境响应产生；以及-比较多个环境响应指纹以检测测定期所述环境响应指纹的改变，其中在测定期所述环境响应指纹的改变程度指示所述细胞系中预测的表型不稳定性程度。典型地，比较多个环境响应指纹以检测测定期环境响应指纹改变的步骤包括：检测所述或每种化学细胞应激源特异性环境响应的改变的步骤。合适地，所述环境响应是生长响应。优选地，所述多个不同时间点在测定期跨越一代或多代。典型地，所述环境响应指纹在测定期内产生三个或更多个时间点。合适地，所述环境响应指纹在测定期内产生四个或更多个时间点。通常，每个环境响应指纹通过在至少三种不同的化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应而产生。优选地，每个环境响应指纹通过在至少五种不同的化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应而产生。合适地，该化学细胞应激源选自于氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透压应激源、氧化应激源、细胞凋亡诱导剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂和毒素。通常，所述细胞系是哺乳动物的生产细胞系。典型地，在测定期的环境响应指纹的改变是测定的数学模型方法，适当地是使用一个或多个具有已知的表型稳定性或不稳定性或二者的细胞环境响应指纹产生的数学模型。典型地，所述数学模型使用选自于欧几里得距离、马哈拉诺比斯距离、LDA距离、PCA距离的方法。本专利技术也提供一种鉴定细胞的系统，该系统包括：-包括多个反应室的装置；-单独设置在所述反应室中的多种化学细胞应激源；-在多种化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应的测定系统；-存储多个环境响应指纹的存储系统，每个环境响应指纹对应细胞的多个环境响应；-配置用于比较多个环境响应指纹中的至少一些以检测环境响应指纹改变的比较系统；以及-显示比较步骤输出的显示系统。合适地，所述环境响应指纹是生长响应指纹。典型地，所述装置是微量滴定板。合适地，所述比较系统包括计算模型，该计算模型配置用于输入在测定期的多个不同时间点的细胞环境响应指纹，比较所述生长响应指纹以检测指纹的改变，并且输出部分基于指纹部分的改变的内容。专利技术详述在本说明书中，术语“细胞”是指任何细胞类型，包括原核或真核细胞。合适地，所述细胞是真核细胞，理想情况下是哺乳动物细胞。典型地，所述细胞是生产细胞，优选地是哺乳动物生产细胞。所述细胞可以是克隆得到的或者非克隆得到的。在优选实施例中，所述细胞是来自一组克隆细胞中克隆体，其来源于单亲细胞群或来源于不同转染细胞。所述细胞也可以是来源于不同的细胞系，比如基因修饰细胞(即“基因敲除”或者“基因敲入”突变细胞)。所述细胞系也可以来源于定向演化，通过选定已经适应特定目标环境的细胞。术语“不同的细胞组”应该理解为彼此不相同的一组细胞。比如，该组细胞可以包括一组所有都来源于单亲细胞群的克隆细胞。或者，该组细胞可以包括独立克隆起源(比如携带有不同转基因或不同突变基因)的细胞，该组细胞可以包括非克隆细胞。所述细胞系也可以来源于定向演化，通过选定已经适应特定目标环境的细胞。该组细胞也可以包括不同细胞类型的细胞，比如不同细胞系、不同细菌或真菌的菌株、同样的细胞类型但是在不同发育阶段的细胞，以及遗传上不同的同样细胞类型的细胞，比如同样类型或起源的细胞或者来源于携带不同转基因的同样亲本细胞群的细胞。在本说明中，术语“克隆细胞组”应该理解为一组克隆细胞群，该克隆细胞群来源于单细胞群并且包括2到500或更多的克隆细胞群。产生克隆细胞组的方法是本领域技术人员熟知的，该方法描述在“Productionofrecombinantproteintherapeuticsincultivatedmammaliancells(在培养哺乳动物细胞中生产重组蛋白治疗剂)”(2004)(Wurm,FlorianM,NewYork,NY,NatureBiotechnology22(2004),S.1393-1398)。典型地，该组克隆细胞群包含10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500个克隆细胞群。典型地，该组克隆细胞群包含100-500、100-400、150-400、150-350个克隆细胞群。本专利技术涉及用多种细胞应激分子孵育细胞。这意味着将所述细胞与每种细胞应激分子单独培养，以在每种细胞应激分子存在时获得所述细胞的生长响应。用所述细胞应激分子孵育细胞可以在任何合适的反应釜中完成，比如在微量滴定板的孔中。典型地，该试验涉及将化学细胞应激源和细胞样品混合起来，并孵育该混合物1到4天，以及测定该细胞生长程度。合适地，该细胞样品的浓度为每毫升混合物有0.1至1.0×106个细胞。典型地，该细胞应激源的浓度为0.5至2×IC50，理想情况下约为1×IC50。合适地，在少于5天的孵育期后测定每种克隆细胞的生长情况。理想情况下，在1-4天之间的培养期后(理想情况下是在2到3天之后)测定每种克隆细胞的生长情况。优选地，同时测定每种克隆细胞的生长。术语“细胞应激分子”或“细胞应激源”应该理解为能通过多种细胞途径中的一种或多种引起细胞生长下降的分子或化合物。典型地，多种化学细胞应激源选自于由氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透压应激源、氧化应激源、细胞凋亡引发剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂以及毒素组成的组。典型地，多种化学细胞应激源包含的应激源选自于包含该组至少4、5、6或者7组：氨基酸转运抑制剂、细胞周期抑制剂、碳源、渗透压应激源、氧化应激源、细胞凋亡引发剂、代谢效应物、pH调节剂、糖酵解抑制剂以及毒素。在本说明书中，应用在细胞应激分子中的术语“多种”应该被理解为表示至少有三种不同的细胞应激分子。典型地，该术语是指至少有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或者20种不同的细胞应激分子。因此，可以通过使用少至三种不同的细胞应激分子实施本专利技术所述方法以产生该细胞特异性生长响应指纹，比如：CoCl2、NAV和MSB；Cadm、MSB和2DG；Cadm、dphe、MeiAB；dphe、MeIAB、Cadm；Dphe、Cad本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预测细胞系表型稳定性的方法，包括步骤：‑在测定期培养细胞系；‑在测定期的多个不同时间点产生细胞系的环境响应指纹，其中每个环境响应指纹通过在三种化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应产生；以及‑比较多个环境响应指纹以检测在测定期环境响应指纹的改变，其中在测定期环境响应指纹的改变程度指示细胞系中预测的表型不稳定性的程度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.04 EP 14163519.31.一种预测细胞系表型稳定性的方法，包括步骤：-在测定期培养细胞系；-在测定期的多个不同时间点产生细胞系的环境响应指纹，其中每个环境响应指纹通过在三种化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应产生；以及-比较多个环境响应指纹以检测在测定期环境响应指纹的改变，其中在测定期环境响应指纹的改变程度指示细胞系中预测的表型不稳定性的程度。2.根据权利要求1所述的方法，其中比较多个环境响应指纹以检测在测定期环境响应指纹的改变的步骤包括：在所述或每种化学细胞应激源特异性环境响应中检测改变的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述环境响应是生长响应。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述多个不同时间点跨越测定期的一代或多代。5.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述环境响应指纹在测定期内的三个或更多个时间点产生。6.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述环境响应指纹在测定期内的四个或更多个时间点产生。7.根据上述任一权利要求所述的方法，其中每个环境响应指纹通过在至少三种不同的化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应产生。8.根据上述任一权利要求所述的方法，其中每个环境响应指纹通过在至少五种不同的化学细胞应激源中的每种存在时测定细胞的环境响应产生。9.根据上述任一权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·汤普森，D·詹姆斯，J·克利福德，
申请(专利权)人：瓦里泰细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：爱尔兰;IE