一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，对鲳鲹进行解剖并分离得到其头肾的巨噬细胞，通过Percoll溶液密度梯度离心方法，提取头肾的巨噬细胞。通过台盼蓝染色的方法对其体外培养的细胞存活数量进行计数，并且检测其一周内的存活状况。通过吞噬实验，测定卵形鲳鯵头肾巨噬细胞对鰤鱼诺卡氏菌和酵母等的吞噬情况，以观察其吞噬功能。通过实验结果可以发现，本发明专利技术能够良好地提取鲳鲹巨噬细胞，并能够良好地观察鲳鲹巨噬细胞的存活情况与吞噬情况。本发明专利技术为进一步研究鲳鲹巨噬细胞的生理学、病理学、毒理学奠定了基础。

A method for microbial characterization of pompanos macrophage phagocytosis

The invention discloses a method for microbial characterization of pompanos phagocytosis of macrophages, pompanos were dissected and isolated from the head kidney macrophages by density gradient centrifugation with Percoll solution method, extraction of head kidney macrophages. The number of cells cultured in vitro was counted by trypan blue staining, and the survival rate of the cells was measured within one week. Through phagocytosis test, determination of phagocytosis of Trachinotus ovatus head kidney macrophages of yellowtail fish Nocardia and yeast, to observe the phagocytosis. The experimental results can be found, the invention can effectively extract pompanos macrophages, and can survive in good condition to observe pompanos macrophages and. The invention relates to a further study of physiological pompanos macrophages and pathology, toxicology foundation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，涉及表征免疫细胞与微生物相互作用的方法，具体涉及一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法。
技术介绍
卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)(Linnaeus)，俗称金鲳，黄腊鲳，属硬骨鱼纲，脊椎动物门，硬骨鱼纲，鲈形目，鲹科，鲳鲹属。卵形鲳鲹体型侧扁，卵圆形，体型大，生长快，抗病力强。自然水域中卵形鲳鲹喜卵形鲳鱼集群觅食洄游，争抢食物凶猛，主要以小型软体动物、小型螺类为食。大的个体有5-10kg，肉细嫩，味鲜美，为名贵的食用鱼类。卵形鲳鲹是一种抗病力较强的海水鱼类，过去关于其病害方面的报道极少。但随着工业化的发展，水产养殖业也越趋现代化，养殖规模不断扩大、养殖密度也逐渐增加，卵形鲳鲹疾病的发生率也不断增高，病毒性、细菌性等的疾病时常出现，其中近年来以诺卡氏菌病例最多。诺卡氏菌病的主要症状为病鱼体表有点状出血斑小而隆起的浓肿，有时口唇部糜烂本病的典型症状是脾脏及肾脏上有白色结节的病变，另一种流行症状主要发生鳃，也叫鳃型诺卡氏菌症，可在鳃上见到直径为5mm的不规则结节，也有两种症状混合出现的。卵形鲳鲹诺卡氏菌病发病率达20％～60％，死亡率10％～30％，未死鱼由于体表溃疡症状也严重影响其市场价值。鱼类诺卡氏菌病主要致病菌为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolea)。鰤鱼诺卡氏菌在分类学上属放线菌目(Actinomycetales)，诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，诺卡氏菌属(Nocardioides)。鰤鱼诺卡氏菌菌体形态为长杆、短杆或分支状；属于放线菌类生物，呈弱抗酸性，在培养基上生长迟缓。其菌落形态呈白色沙粒状，培养3-7天可转变为黄色沙粒状。近年来水产动物病害进行免疫学角度的研究，对于病害防控和治疗以后的发展越来越重要，并且逐渐成为研究的热点。鱼类头肾是其重要的免疫器官，头肾的巨噬细胞是非特异性防御系统的重要的细胞。当受到病原生物的入侵时，巨噬细胞将被激活并吞噬病原体，并且发生一系列反应杀死病原生物。同时其免疫活性参数溶酶体活性、补体活性的都得到加强。巨噬细胞的吞噬作用(phagocytosis)是指细胞把入侵的病原体(如细菌和病毒)转运到细胞内并加以清除的过程。此过程构成生物体先天免疫的第一道防线。吞噬作用是所有后生动物的一种原始的防御机制。现今，在水产养殖方面，诺卡氏菌对鱼类的影响越来越严重，而相关的研究却还比较少，所以探讨鱼类本身对于诺卡氏菌等细菌的免疫，将有利于我们更好地了解卵形鲳鲹对于鰤鱼诺卡氏菌的免疫情况。从而有利于我们更好地研究出防控其病害影响的药物，同时也为其他鱼类巨噬细胞对于诺卡氏菌的病害防控的研究提供一个参考。促进卵形鲳鲹水产养殖业的发展，并且为水产养殖户提供一定的理论知识，帮助他们获得更好的收益。有关卵形鲳鲹免疫功能的报道较少，头肾是鱼类的重要免疫器官，未见到卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的分离、纯化、培养和表征的报道。对卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的分离、纯化、培养和表征为卵形鲳鲹巨噬细胞的生理学、病理学、毒理学等方面奠定基础，有利于更深入地研究卵形鲳鲹的免疫功能，有利于研究微生物-卵形鲳鲹的致病机理，有利于研究卵形鲳鲹对微生物等成分的吞噬作用，有利于对卵形鲳鲹病害的控制，为卵形鲳鲹巨噬细胞的分子生物学研究提供材料保障。本文相关
技术介绍
：袁思平,王国良,金珊.养殖鱼类致病诺卡氏菌研究进展[J].微生物学通报,2006,33(2):137-141.XiaLQ,CaiJ,WangB,HuangYC,JianJC,LuYS.DraftgenomesequenceofNocardiaseriolaeZJ0503,afishpathogenisolatedfromTrachinotusovatusinChina.Genomeannouncements,2015,3(1):e01223-14.黄郁葱,简纪常,吴灶和,等.卵形鲳鲹结节病病原的分离与鉴定[J].广东海洋大学学报,2008,28(4):49-53.王瑞旋,刘广锋,王江勇,等.养殖卵形鲳鲹诺卡氏菌病的研究[J].海洋湖沼通报,2010(1):52-58.满其蒙,徐力文,区又君,等.鰤鱼诺卡氏菌感染卵形鲳鲹的组织病理学研究[J].广东农业科学,2012,39(21):132-135.DoVA,MarquesF,SilvaMT.Apoptosisofseabass(DicentrarchuslabraxL.)neutrophilsandmacrophagesinducedbyexperimentalinfectionwithPhotobacteriumdamselaesubsp.piscicida.[J].Fish&ShellfishImmunology,2003,15(2):129-44.SchultzeJL,SchmidtSV.Molecularfeaturesofmacrophageactivation.[J].SeminarsinImmunology,2016,27(6):416-423.
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的：1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片，并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域，所述圆形区域的直径为1.5cm；2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域，所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl，所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml；3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25℃条件下培养1-2小时；4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后，用25℃左右的L-15洗涤所述载玻片；5).将50μl细菌悬液加入所述圆形区域，巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例；6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min；7).用磷酸盐缓冲液或L-15洗所述载玻片5次；8).用100μl100％甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min，用70％甲醇冲洗所述载玻片5次；9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片；10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况。可选地，所述微生物细胞为鰤鱼诺卡氏菌细胞，步骤5)中用含20％(v/v)鲳鲹血清的L-15制备鰤鱼诺卡氏菌悬液，浓度为1×107cfu/ml，在20℃，孵育30分钟；用PBS洗菌2次，3000rpm，10min；用含5％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15将所述鰤鱼诺卡氏菌悬液浓度调整到2×107cfu/ml。可选地，所述微生物细胞可为酵母菌细胞，步骤5)中酵母悬液的制备方法为：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鲳鲹血清或小牛血清的L-15。为了获取鲳鲹巨噬细胞，所述鲳鲹巨噬细胞可按照下面的步骤制备：a.解剖鲳鲹，取出头肾；b.将所述头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上，该细胞筛下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5mlL-15培养基的培养皿；c.将所述培养皿放置冰块上，在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾，使所述头肾细胞落入所述含L-15的培养皿中形成鲳鯵细胞悬液；d.将细胞悬液贴壁轻柔的转移到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的：1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片，并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域，所述圆形区域的直径为1.5cm；2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域，所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl，所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml；3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25oC条件下培养1‑2小时；4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后，用25oC左右的L‑15洗涤所述载玻片；5).将50μl微生物细胞悬液加入所述圆形区域，巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例；6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min；7).用磷酸盐缓冲液或L‑15洗所述载玻片5次；8).用100μl 100％甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min，用70％甲醇冲洗所述载玻片5次；9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片；10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况。

【技术特征摘要】
1.一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的：1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片，并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域，所述圆形区域的直径为1.5cm；2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域，所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl，所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml；3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25oC条件下培养1-2小时；4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后，用25oC左右的L-15洗涤所述载玻片；5).将50μl微生物细胞悬液加入所述圆形区域，巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例；6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min；7).用磷酸盐缓冲液或L-15洗所述载玻片5次；8).用100μl100％甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min，用70％甲醇冲洗所述载玻片5次；9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片；10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况。2.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述微生物细胞为鰤鱼诺卡氏菌细胞，步骤5)中用含20％(v/v)鲳鲹血清的L-15制备鰤鱼诺卡氏菌悬液，浓度为1×107cfu/ml，在20℃，孵育30分钟；用PBS洗菌2次，3000rpm，10min；用含5％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15将所述鰤鱼诺卡氏菌悬液浓度调整到2×107cfu/ml。3.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述微生物细胞为酵母菌细胞，步骤5)中酵母悬液的制备方法为：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鲳鲹血清或小牛血清的L-15。4.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述鲳鲹巨噬细胞是按照下面的步骤制备的：a.解剖鲳鲹，取出头肾；b.将所述头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上，该细胞筛下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5mlL-15培养基的培养皿；c.将所述培养皿放置冰块上，在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾，使所述头肾细胞落入所述含L-15的培养皿中形成鲳鯵细胞悬液；d.将细胞悬液贴壁轻柔的转移到Percoll梯度离心管的34％Percoll层之上；e.移动加样完毕的所述Percoll梯度离心管，于4℃，400g，离心25分钟；f.用无菌吸管小心吸取并弃去所述Percoll梯度离心管的上层34％Percoll液体，再用无菌吸管...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏立群，鲁义善，简纪常，蔡佳，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44