间皮素抗体和引起有效的抗肿瘤活性的方法技术

本发明专利技术描述了使用噬菌体展示抗体工程技术和合成肽筛选法，来确定针对间皮素的人源单域抗体SD1和SD2。SD1识别靠近细胞表面的人的间皮素的C-末端(残基539-588)的构象表位。SD2结合全长的间皮素。为了研究作为潜在的治疗剂的SD1，生成了重组的人源Fc(SD1-hFc)融合蛋白。SD1-hFc蛋白对于表达间皮素的肿瘤细胞，除了抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)外，还展现了很强的补体-依赖的细胞毒性(CDC)。此外，在裸鼠体内中，SD1-hFc蛋白对异种移植瘤具有显著的肿瘤生长抑制作用。SD1和SD2是第1个靶向表达间皮素的肿瘤的人源单结构域抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用相关申请本申请要求2012年9月27日提交的美国临时申请号61/706,396的权益，在此整体引入该申请的内容。
本公开涉及单克隆抗体，如特异于间皮素的单域的单克隆抗体。本公开进一步涉及该抗体的使用，如用于癌症的诊断和治疗。
技术介绍
由于间皮素在恶性间皮瘤中高度表达(Chang等，Cancer Res 52：181-186，1992；Chang和Pastan，proc Natl Acad Sci USA 93：136-140，1996)以及在其它实体肿瘤，如胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌和卵巢癌症中高度表达，因此间皮素被认为是一个治疗靶点。(Hassan等，Clin.Cancer Res.10：3937-3942，2004；McGuire等，N.Engl.J.Med.334：1-6，1996；Argani等，Clin.Cancer Res.7：3862-3868，2001；Hassan等，Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.13：243-247，2005；Li等，Mol.Cancer Ther.7：286-296，2008；Yu等，J Cancer 1：141-1749，2010；Tchou等，Breast Cancer Res Treat 133(2)：799-804，2012；美国专利号7,081,518)。间皮素(MSLN)基因编码～70kDa的前体蛋白，该蛋白被加工形成～30kDa N端蛋白和～40kDa的C端膜结合成熟间皮素(Hassan和Ho，Eur J Cancer 44：46-53，2008)。在过去近20年里，开发了许多抗间皮素的单克隆抗体(mAb)，包括SS1P免疫毒素和MORAb-009(也称阿麦妥昔单抗(Amatuximab))，该抗体目前在进行针对于间皮瘤和其它癌症的临床试验的评估(Hassan和Ho，Eur J Cancer 44：46-53，2008；Ho，Biodrugs 25：275-284，2011)。SS1P是重组的免疫毒素，由与截短的假单胞菌外毒素融合的小鼠的抗间皮素Fv组成，其介导细胞杀伤(Pastan和Hassan，Nat Rev Cancer 6：559-565，2006)。关于SS1P的联合化疗的临床试验目前正在进行。基于小鼠SS1Fv的嵌合(鼠/人)抗体MORAb-009在具有间皮素的肿瘤细胞上引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)(Hassan等，Cancer Immure 7：20，2007)。最近美国国家癌症研究所(NCI)的研究人员制备了两个完全人源的识别间皮素的单克隆抗体(m912和HN1)(Feng等，Mol Cancer Ther 8：1113-1118，2009；Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011)。自噬菌体展示库分离HN1人源Fv，并且生成完全人源化IgG。通过将HN1 Fv融合到截短的假单胞菌外毒素A(PE38)而产生HN1的免疫毒素(Ho等，Int J Cancer 128：2020-2030，2011)。HN1的IgG结合于与细胞表面相关联的间皮素并且通过非常强的ADCC来对肿瘤细胞进行杀伤。HN1人源抗体识别重叠间皮素中的SS1位点的构象表位，其表明HN1可以开发成基于SS1的单克隆抗体的完全人源化版本(如MORAb-009)。虽然已知的许多间皮素单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针对于肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，目前靶向间皮素的治疗由于缺乏具有强效的CDC的抗间皮素的单克隆抗体而被阻碍。CDC是治疗性抗体的重要的细胞杀伤机制(Weiner等，Nat Rev Immunol 10：317-327，2010)。第一个被批准的癌症治疗的单克隆抗体，利妥昔单抗，对于其抗肿瘤活性，部分依赖于CDC。在临床前的研究中，它的抗肿瘤活性在C1q缺失的小鼠中完全丧失(abolished)(Di Gaetano等，J Immunol 171：1581-1587，2003)。在B细胞淋巴瘤的异种移植模型中补体的耗尽也降低其活性(Cragg和Glennie，Blood 103：2738-2743，2004)。目前认为当结合于位点的抗体靠近细胞膜时CDC才可能发生(Pawluczkowycz等，J Immunol 183：749-758，2009)。作为这一解释的依据，奥法木单抗(ofatumumab)，其比利妥昔抗体更靠近细胞膜进行结合，而其CDC的活性也更高(Pawluczkowycz等，J Immunol 183：749-758，2009)。几乎所有现有的间皮素单克隆抗体和免疫毒素(包括HN1和SS1P/MORAb-009)识别I区域，细胞表面的间皮素的N末端被推测为远离细胞膜(Kaneko等，J Biol Chem 284：3739-3749，2009)。
技术实现思路
本专利技术公开了间皮素特异性人源单域(VH)抗体(简称为SD1和SD2)。SD1抗体结合在人的间皮素的C末端的构象表位，并且对于表达间皮素的肿瘤细胞展现出很强的CDC活性以及ADCC。SD2特异于全长的人的间皮素，但不能结合间皮素的C末端间皮素肽。本专利技术提供的是包含SD1或SD2的一个或者多个(诸如所有的三个)CDR的单克隆抗体。本专利技术提供的抗体包括免疫球蛋白分子，例如IgG抗体，以及抗体片段和单域(VH)抗体。进一步提供组合物，所述组合物包含结合(例如特异性结合)于间皮素的抗体、编码这些抗体的核酸分子、包括所述核酸分子的表达载体、以及表达所述核酸分子的分离的宿主细胞。本专利技术还提供了免疫偶联物，所述免疫偶联物包含本文所公开的抗体和效应分子(例如毒素)。也提供了包含所述抗体的融合蛋白，例如包含人的Fc的融合蛋白。在此提供的抗体和组合物可用于各种目的，例如用于确定表达间皮素的癌症的诊断，所述癌症诸如为间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌)或卵巢癌。因此，在此提供了在受试对象中确定癌症的诊断的方法，所述确定癌症的诊断通过使来自于被诊断为癌症的受试对象的样本与结合间皮素的单克隆抗体进行接触，并检测所述样本与所述抗体的结合来进行。根据所述抗体与所述样本的结合相对于所述所述抗体与对照样本的结合的增加来确定癌症的诊断。在一些实施方案中，该方法进一步的包括使特异性识别所述特异性间皮素抗体的第二抗体与所述样本接触，以及检测所述第本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的特异性结合人的间皮素的单克隆抗体，其中所述抗体的VH结构域包括：(i)SEQ ID NO：2的氨基酸残基26‑35、51‑58和97‑103；(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基31‑35、51‑66和99‑102；(iii)SEQ ID NO：15的氨基酸残基26‑33、51‑57和96‑111；或(iv)SEQ ID NO：15的氨基酸残基31‑35、50‑65和99‑106。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.09.27 US 61/706,3961.分离的特异性结合人的间皮素的单克隆抗体，其中所述抗体的VH
结构域包括：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸残基26-35、51-58和97-103；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸残基31-35、51-66和99-102；
(iii)SEQ ID NO：15的氨基酸残基26-33、51-57和96-111；或
(iv)SEQ ID NO：15的氨基酸残基31-35、50-65和99-106。
2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述VH结构域的氨
基酸序列至少90％或至少95％与SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：15是相同
的。
3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述VH结构域的氨
基酸序列包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：15。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体
是单结构域抗体。
5.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体
是Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链可变片段(scFv)、或二硫化物稳
定的可变片段(dsFv)。
6.如权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体
是IgG。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体
是嵌合的或合成的。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体
被标记。
9.如权利要求8所述的分离的单克隆抗体，其中所述标记是荧光标记、
酶标记或者放射性标记。
10.分离的免疫偶联物，其包括权利要求1-9中任一项所述的单克隆
抗体和效应分子。
11.如权利要求10所述的分离的免疫偶联物，其中所述效应分子是毒
素。
12.如权利要求11所述的分离的免疫偶联物，其中所述毒素是假单胞
菌外毒素或其变体。
13.如权利要求12所述的分离的免疫偶联物，其中所述假单胞菌外毒
素或其变体包括SEQ ID NOs：3-8中的任一个的氨基酸序列。
14.融合蛋白，其包括权利要求1-9中任一项所述的抗体和异源蛋白。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中异源蛋白是人的Fc。
16.组合物，其包括在药学上可接受的载体中的治疗有效量的权利要求
1-9中任一项所述的单克隆抗体、权利要求10-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：何苗壮，I·H·帕斯坦，D·S·迪米特洛夫，唐喆伟，丰明乾，高威，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：美国;US