增强抗体活性的方法技术

制备并纯化抗人Ｍｐｌ抗体，进而使用基因工程方法制备了抗人Ｍｐｌ抗体的单链抗体。该抗体显示出高激动剂活性。这表示，通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区形成单链多肽，可以增强抗体的活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。
技术介绍
由于抗体在血中的稳定性高而抗原性低，因此作为药物受到人们关注。一般认为，这些抗体中，识别受体等在细胞表面表达的蛋白质，并能够在细胞中引起特异性反应的激动剂抗体作为药物是有用的。现已报道了几种激动剂抗体，如针对红细胞生成素受体的激动剂抗体(参照专利文献1)，针对血小板生成素受体的激动剂抗体和针对CD47的激动剂抗体(参照专利文献1和2)等。分别以各种测试法测定这些激动剂抗体的激动剂活性(アゴニスト活性)，然而如果将其活性与天然配体比较的话，这些抗体的活性都很弱。例如，针对属于细胞因子受体家族的血小板生成素受体的激动剂抗体，为了显示其激动剂活性，必须首先使TPO受体二聚体化，并使其保持适当的距离以利于信号传递。然而，由于抗体分子是二价的，因此认为受体的二聚体化没有问题，但其通常是分子量约为150kD的巨大分子，结构的自由度小，因此预计由于难以使之与结合的受体保持适于信号传递的距离，因而无法充分传递活性。专利文献1WO02/33072A专利文献1WO02/33073A非专利文献1Elliott S等人，J.Biol.chem..，1996年，Vol.271(40)，p24691-24697专利技术的公开专利技术要解决的问题本专利技术是鉴于上述状况完成的，其目的在于提供使抗体活性增强的方法。具体而言，旨在通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区，形成单链多肽，使抗体活性增强的方法。用于解决问题的方法低分子化抗体(minibody)，具体的是，双抗体或sc(Fv)2，其分子量为约60kD，低于完整抗体的二分之一，进而推定其结构上的自由度也比较高，因此认为也能够比配体更为有效地或者与其相同程度地使受体二聚体化，因而认为所述抗体能够显示出高活性。本专利技术人制备并纯化了抗人Mpl抗体，进而使用基因工程方法制备了抗人Mpl抗体VB22B的单链抗体。进而，构建抗人Mpl抗体sc(Fv)2表达载体，在CHO-DG44细胞中进行单链抗体的瞬时表达，从培养上清中制备了抗人Mpl单链抗体VB22B sc(Fv)2。并且，作为对照，构建抗人Mpl双抗体表达载体，使用COS7细胞，从其培养上清中制备了VB22B双抗体。在评价各种抗体的TPO样激动剂活性时，确认了单链抗体的激动剂活性高。这表示，通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区、及两个或两个以上的轻链可变区形成单链多肽，可以增强抗体的活性。总之，本专利技术涉及一种使抗体的活性增强的方法，更为具体地涉及以下内容(1)通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区，形成单链多肽，使抗体活性增强的方法；(2)通过以接头结合含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽，和含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽，使抗体活性增强的方法；(3)通过将抗体制成sc(Fv)2，使抗体的活性增强的方法；(4)根据(1)-(3)任一项记载的方法，所述活性是激动剂活性；(5)根据(1)-(4)任一项记载的方法，其特征在于所述接头是肽接头；(6)根据(5)记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为5-30个氨基酸；(7)根据(6)记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为12-18个氨基酸；(8)根据(7)记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为15个氨基酸； (9)通过(1)-(8)任一项记载的方法使其活性增强的抗体；(10)(9)记载的抗体的制备方法，其包括以下步骤(a)制备编码两个或两个以上的抗体重链可变区、两个或两个以上的抗体轻链可变区，和结合各可变区的肽接头的DNA的步骤，(b)制备含有该DNA的载体的步骤，(c)将该载体导入宿主细胞的步骤，(d)培养该宿主细胞的步骤；(11)根据(10)记载的制备方法，其特征在于所述DNA编码两个重链可变区，两个轻链可变区，和3个肽接头；(12)根据(11)记载的制备方法，其特征在于所述DNA按重链可变区，肽接头，轻链可变区，肽接头，重链可变区，肽接头，轻链可变区的顺序编码。附图的简要说明附图说明图1是表示抗人Mpl抗体(H链和L链)的氨基酸序列图。图中所示VB140(H链)的氨基酸序列表示于序列号19，VB45B(H链)的氨基酸序列表示于序列号20，VB22B(H链)的氨基酸序列表示于序列号21，VB16(H链)的氨基酸序列表示于序列号22，TA136(H链)的氨基酸序列表示于序列号23。此外，VB140(L链)的氨基酸序列表示于序列号24，VB45B(L链)的氨基酸序列表示于序列号25，VB22B(L链)的氨基酸序列表示于序列号26，VB16(L链)的氨基酸序列表示于序列号27，TA136(L链)的氨基酸序列表示于序列号28。图2是表示单链抗体sc(Fv)2制备过程的图。图3是表示使用BaF3-人Mpl评价VB22B抗体的激动剂活性的结果的图。图4是表示使用BaF3-猴Mpl评价VB22B抗体的激动剂活性的结果的图。图5是表示使用BaF3-人Mpl评价VB16抗体的激动剂活性的结果的图。图6是表示使用BaF3-人Mpl评价VB140抗体的激动剂活性的结果的图。图7是表示使用BaF3-人Mpl评价VB45B抗体的激动剂活性的结果的图。图8是表示使用BaF3-人Mpl评价TA136抗体的激动剂活性的结果的图。用于实施专利技术的最佳方式本专利技术提供了一种通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区，形成单链多肽，由此使抗体的活性增强的方法。根据本专利技术的方法，活性得以增强的抗体可以是任意抗体，可以是小鼠抗体，人抗体，大鼠抗体，兔抗体，骆驼抗体等任意动物来源的抗体。进而，例如，所述抗体既可以是嵌合抗体，人源化抗体等包含经取代的氨基酸序列的修饰的抗体，也可以是结合了各种分子的抗体修饰物，抗体片段，经糖链修饰的抗体等任意一种抗体。并且，由于本专利技术的抗体活性得以增强的抗体，既可以是全长抗体，也可以是双抗体等低分子化抗体。作为本专利技术的单链多肽，可以例举有，例如，将含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽与含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽以接头结合起来所形成的单链多肽。含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽与含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽，既可以是相同的多肽，也可以是不同的多肽。当第一多肽与第二多肽不同时，既可以是识别相同抗原或表位的抗体，也可以是识别不同的抗原或表位的双特异性抗体(bispecific antibody)。作为含有抗体的重链可变区和轻链可变区的多肽的具体例子，可以例举有，例如sc(Fv)(单链Fv)。因此，作为以接头结合的含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽和含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽的单链多肽，可以例举有sc(Fv)2。sc(Fv)2是以接头结合两个重链可变区和两个轻链可变区形成单链多肽的抗体(Hudson等人，J Immunol.Methods 1999；231177-189)。形成sc(Fv)2时，相结合的两个重链可变区(VH)和两个轻链可变区(VL)的顺序没有特别的限定，无论按何顺序连接均可，例如，可以例举有如下的排列接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头-接头本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区形成单链多肽，使抗体活性增强的方法。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：大友俊彦，薮田尚弘，角田浩行，土屋政幸，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]