一种棕榈酰化七肽、及其纯化方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种棕榈酰化七肽及其纯化方法和应用，通过棕榈酰化修饰七肽获得增强多肽抗肿瘤活性的多肽。获得的棕榈酰化七肽的氨基酸序列如下所示：Palm‑Glu‑Tyr‑Phe‑Asp‑Ala‑Leu‑Ala，缩写为Palm‑EYFDALA，分子量1066.34Da。本发明专利技术获得的棕榈酰化七肽具有增强的抗肿瘤活性，同时还具有抗衰老活性，可应用于生物制药、食品、化妆品等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种棕榈酰化七肽、及其纯化方法和应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种棕榈酰化七肽、及其在抗肿瘤制剂、化妆品或食品中的应用。
技术介绍
根据世界卫生组织(WHO)统计，全世界有3/5的人死于癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系统疾病这4大类疾病，而癌症则是最主要的死因之一。2008年全球死于癌症的患者达760万人，占全球死亡人数的13％，其中超过70％的癌症死亡案例发生在中低收入国家，预测至2030年，全球将有超过110万人死于癌症。目前，对于癌症的治疗，药物治疗仍然是重要手段之一。因此，研究开发具有抗肿瘤活性的物质或制剂也一直是本领域技术人员的研究热点之一。小分子肽是一类具有高活性的肽类物质，小分子肽可以以完整的形式被机体吸收；主动吸收、低耗或不需消耗能量的特点；能够直接进入血液循环并送到人体各个部位，广泛应用于生物医药领域。由于具有亲水性，蛋白质通常难以跨生物膜转运，因此，提高其膜渗透性改善其细胞内化率是重要的科学问题。通过对小分子肽进行修饰使其性能得以改善，也是本领域技术人员的研究方向之一。而开发具备抗肿瘤活性的小分子肽更是备受关注。棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式之一，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中都起着重要的作用。根据连接方式不同，棕榈酰化可分为N型(棕榈酸盐通过酰胺键连接到Gly/Cys残基上)和S型(棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到Cys的巯基上)。
技术实现思路
本专利技术提供一种经棕榈酰化的七肽(Palm-EYFDALA)，本专利技术的棕榈酰化七肽相比于未经棕榈酰化的七肽具有明显增强的抗肿瘤活性，而且具有很好的抗氧化活性，可应用于生物制药和化妆品领域。本专利技术提供的棕榈酰化七肽，缩写为Palm-EYFDALA，分子量1066.34Da，序列为Palm-Glu-Tyr-Phe-Asp-Ala-Leu-Ala，其化学结构式如下：其中，前文序列中的Palm表示英文名称为Palmitoyl，中文名称为棕榈酰基；Glu表示英文名称为Glutamicacid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；Asp表示英文名称为Asparticacid，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；Leu表示英文名称为Leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基。本专利技术还提供上文所述的棕榈酰化七肽的纯化方法，可通过该方法来纯化通过多肽固相合成的棕榈酰化七肽，从而获得纯度大于95％的多肽。该方法包括如下步骤：将待纯化的棕榈酰化七肽上样至色谱柱；以流动相A和流动相B为洗脱液进行梯度洗脱，其中流动相A为含有0.08～0.12％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.08～0.12％三氟乙酸的水；梯度洗脱程序为：流动相A的初始体积比例为22～28％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到62～67％，在第25min到第25.1min内，流动相A的体积比例上升为100％，保持100％运行至第30min停止，检测波长为220nm；收集目标峰的多肽溶液。进一步的，所述色谱柱为C18色谱柱。优选的，流动相A为含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的水；和/或，梯度洗脱过程中，流动相A的初始体积比例为25％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到64％。本专利技术提供的棕榈酰化七肽还可在制备抗肿瘤药物中应用。进一步的，所述棕榈酰化七肽可在制备广谱抗肿瘤药物中应用。所述肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌。进一步的，所述棕榈酰化七肽对HepG2、A549、SGC-7901、MCF-7、HT-29的细胞增殖抑制率达到70％以上。本专利技术提供的棕榈酰化七肽还可应用于化妆品或食品中。所述棕榈酰化七肽作为抗氧化活性成分和/或抗衰老活性成分应用于化妆品或食品中。本专利技术还提供一种组合物，所述组合物中含有如权利要求1所述的棕榈酰化七肽。进一步的，所述组合物可为抗肿瘤药物、化妆品或食品。实验发现，本专利技术提供的经棕榈酰化的七肽，与修饰前的七肽相比，抗肿瘤活性显著增强，且表现出广谱抗癌活性。对HepG2、A549、SGC-7901、MCF-7、HT-29等癌细胞的增殖抑制作用均超过70％。另外，还发现本专利技术的七肽还具有较强的ABTS自由基清除活性。本专利技术提供的经棕榈酰化的抗肿瘤七肽可应用于抗肿瘤药物的制备，更进一步的，可以应用于广谱抗肿瘤药物的制备。所述肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌等。本专利技术提供的经棕榈酰化的抗肿瘤七肽还可作为抗氧化活性成分和/或抗衰老活性成分应用于化妆品中，即，可以用于制备抗氧化功能和/或抗皮肤衰老功能的化妆品。附图说明图1为棕榈酰化七肽(Palm-EYFDALA)的纯度鉴定HPLC图。图2为棕榈酰化七肽(Palm-EYFDALA)的ESI-MS图谱。其中横坐标为m/z(质荷比值)、纵坐标为intensity(信号强度)。图3为七肽(EYFDALA)与棕榈酰化七肽(Palm-EYFDALA)抗肿瘤活性比较图。其中横坐标为测试样品、纵坐标为肿瘤抑制率。图4为棕榈酰化七肽的抗氧化活性图。其中，A为棕榈酰化七肽在0-40min范围内对ABTS自由基清除活性的动力学过程；B为不同浓度的棕榈酰化七肽在反应40min时测得的ABTS自由基清除活性。注：小写字母a-c表示不同峰之间的显著性差异，按照字母表的顺利由大到小排列，相邻字母间P＜0.05，差异显著。图5为棕榈酰化七肽对黑色素瘤细胞A375的增殖抑制活性评价，在化妆品中应用广泛的五胜肽Matrixyl为阳性对照。注：a-c表示不同峰之间的显著性差异，按照字母表的顺利由大到小排列，相邻字母间P＜0.05，差异显著。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术的实施和保护范围不限于此。以下实施例中所用细胞或试剂若未特别说明，均为商业渠道购买获得。下文实施例中所述七肽均为EYFDALA，棕榈酰化七肽均为Palm-EYFDALA。通过多肽固相合成法合成Palm-EYFDALA，采用本领域常规多肽固相合成方法，具体可以通过商业生物合成公司来完成该多肽的合成。氨基酸序列采用本领域常规的标准Fmoc方案，下面对多肽固相合成进行介绍以供参考。多肽固相合成：选用二氯三苯甲基树脂(上海杰肽生物科技有限公司)，按照氨基酸序列Glu-Tyr-Phe-Asp-Ala-Leu-Ala的特征，先将Ala的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Ala的氨基和Leu的羧基缩水反应，处理后，再添加Ala，Leu的氨基和Ala的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Glu氨基酸后，再切除树脂即得到七肽EYFDALA。氨基酸链合成完毕后，将活化好的棕榈酸在苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)的催化下与肽链N端氨基反应，使用比例根据前面氨基酸的整体酸碱性更改。整个过程把棕榈酸当做一个氨基酸来参与正常反应，后面不再链接氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棕榈酰化七肽，其特征在于，其化学结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种棕榈酰化七肽，其特征在于，其化学结构式如下：2.如权利要求1所述的棕榈酰化七肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：将待纯化的棕榈酰化七肽上样至色谱柱；以流动相A和流动相B为洗脱液进行梯度洗脱，其中流动相A为含有0.08～0.12％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.08～0.12％三氟乙酸的水；梯度洗脱程序为：流动相A的初始体积比例为22～28％，在上样后的第0.01min到第25min内，流动相A的体积比例上升到62～67％，在第25min到第25.1min内，流动相A的体积比例上升为100％，保持100％运行至第30min停止，检测波长为220nm；收集目标峰的多肽溶液。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述色谱柱为C18色谱柱；和/或，流动相A为含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含有0.1％三氟乙酸的水；和/或，梯度洗脱过程中，流动相A的初始体积比例为25％，在上样后的第0.01min到第...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾巧辉，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44