内毒素的测定方法和内毒素的测定用试剂盒技术

本发明专利技术提供一种不易受样品混浊或颜色的影响、能够迅速且简便地进行内毒素检测或浓度测定的技术。制作使ＬＡＬ中所含的蛋白质吸附或结合在预先准备且分散于药液中的微粒上的试剂，使该试剂与含有内毒素的样品混合。由此，使内毒素作用于微粒上的蛋白质，使微粒彼此聚集，迅速地生成大的凝聚体。对该凝聚体的生成进行光学测定，由此进行内毒素的检测或浓度测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测内毒素或测定其浓度的方法，以及用于其检测或浓度测定的试剂盒。
技术介绍
内毒素是在革兰氏阴性菌的细胞壁中存在的脂多糖，是最具代表性的热源。如果被内毒素污染的输液、注射药剂、血液等进入人体，则存在引起发热或休克等重度副作用的可能。因此，有义务管理上述的药剂、器具等，以使其不被内毒素污染。在鲎的血细胞提取物(以下，也称作“LAL：鲎变形细胞裂解物”)中，存在被内毒素活化的丝氨酸蛋白酶。并且，在LAL与内毒素反应时，对应于内毒素的量所活化的丝氨酸蛋白酶引起酶的级联，由此在LAL存在的凝固蛋白原水解为凝固素并发生聚集，生成不溶性的凝胶。作为测定该内毒素的浓度的方法，具有半定量的凝胶化法：将与LAL混合的样品静置，在一定时间后翻转容器，根据样品有无垂落判断是否发生凝胶化，确定在样品中是否含有一定浓度以上的内毒素。另外，作为内毒素的其它高灵敏度定量法，具有随着LAL和内毒素反应引起的凝胶的生成，经时性地测定样品的混浊并进行解析的比浊法，或使用由酶的级联引起水解并发色的合成基质的比色法。在上述的定量法中，比浊法存在在使低浓度的内毒素作用时，由于被活化的酶少因此到检测出凝胶的生成为止需要非常长的反应时间的情况。另一方面，比色法存在容易受样品的混浊(血脂等)或混入的色素(溶血所致的血红蛋白等)影响的不良情况。由于这些情况，特别是在急救时测定患者血液中的内毒素，或在人工透析时测定透析液或血液中的内毒素时，不能说上述比浊法或比色法是最合适的方法。另外，提出激光散射粒子测量法：通过搅拌使LAL和内毒素混合得到的样品使微粒迅速生成，同时由被凝胶微粒散射的激光的强度解析凝胶微粒的大小和数量，测定凝聚初期的凝胶微粒生成。有报告称，根据该方法，与比浊法相比，可以使测定时间缩短至三分之一，且可以降低样品的混浊或颜色的影响。但是，即使使用上述的激光散射粒子测量法，在1EU(内毒素单位)/L左右的低浓度的内毒素的测定中，也需要40～50分钟的测定时间。另外，在激光散射粒子测量法中，由于观察微小空间区域的粒子，因此存在光学体系变得复杂，难以进行多样本测定的不良情况。专利文献1：日本专利第2667695号公报
技术实现思路
本专利技术是鉴于上述问题作出的专利技术，其目的在于，提供一种不易受样品混浊或颜色的影响、能够迅速且简便地进行内毒素检测或浓度测定的技术。本专利技术所述的内毒素的测定方法以以下方面为最大特征。即，制作在LAL中所含-->的蛋白质吸附或结合在预先准备且分散于药液中的微粒之上的试剂。并且，通过使含有内毒素的样品作用于该试剂，使微粒彼此聚集，迅速地生成大的凝聚体，检测该凝聚体的生成，由此进行内毒素的测定。更具体地，是检测样品中的内毒素或测定样品中的内毒素的浓度的内毒素的测定方法，其特征在于，使在鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结合或吸附在可分散于试剂中的微粒的表面，使结合或吸附上述蛋白质的上述微粒分散得到的试剂和样品混合，通过检测上述试剂和上述样品的混合液中的凝胶生成，进行内毒素的检测，或通过测定上述凝胶的生成程度，测定内毒素的浓度。在此，通过申请人的深入研究，可知如果在LAL中所含的蛋白质结合或吸附在例如树脂制的微粒上的状态下，使内毒素起作用，则与使含有内毒素的样品作用于LAL单体的情况相比，可以迅速地生成更大的凝聚体。这是由于，微粒上的凝固蛋白原通过LAL中的酶的级联水解，生成凝固素，这些微粒彼此聚集的原因。另外，还明确了该凝集反应不易受样品混浊或颜色的影响，而且，该凝集反应与用LAL单体引起的凝集反应相比，非常强大。在本专利技术中，利用这种现象，制作LAL中所含的蛋白质结合或吸附在微粒上的试剂，使含有内毒素的样品作用于该试剂(以下，也称为“LAL试剂”)，由此使微粒彼此聚集，而迅速地生成更大的凝聚体，促进LAL试剂和样品的混合液中的凝胶的生成。这样，在内毒素的检测和浓度测定(以下，也将这些合并称为“内毒素的测定”)中，可以降低样品混浊或颜色的影响，另外，可以更加迅速且简便地进行检测和浓度测定。应予说明，上述的规定蛋白质是具有与内毒素反应并生成凝胶的特性的物质，至少含有凝固蛋白原。另外，也可以含有丝氨酸蛋白酶等其它的蛋白质。另外，在本专利技术中，凝胶的生成的意思是指，包含上述的微粒彼此聚集引起的凝聚体的生成，未结合或吸附至微粒的凝固素聚集引起的凝胶粒子的生成，LAL试剂和样品的混合液的凝胶化中的至少任一现象。另外，在本专利技术中，凝胶生成的程度的意思是指，例如，上述微粒彼此聚集引起的凝聚体，和未结合或吸附至微粒的凝固素聚集引起的凝胶粒子的大小或数目的增加。或者，意思是LAL试剂和样品的混合液的凝胶化引起的混合液的物理、化学特性(例如，浊度)的变化。此处，上述规定蛋白质可以是由鲎的血细胞提取物纯化得到的凝固蛋白原。如上所述，在使内毒素作用于LAL时的凝集反应中，凝固蛋白原通过LAL中的酶的级联水解，生成凝固素，这些微粒彼此聚集。因此，通过预先纯化LAL中的蛋白质，只提取凝固蛋白原并事先结合或吸附至微粒，可以更有效地使微粒彼此聚集，可以更迅速地生成凝聚体。另外，在本专利技术中，在上述规定蛋白质含有丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原时，在上述规定蛋白结合或吸附的上述微粒分散的试剂中，在试剂的制备过程中，还可以添加抑制该试剂中的丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反应的抑制剂。其中，在LAL中所含的蛋白质结合或吸附于微粒上时，首先，使能够结合、吸附蛋白质的官能团存在于微粒的表面。并且，在该状态下使LAL试剂起作用，使蛋白质化学结合-->至微粒表面，或使其静电性地、亲水性地、疏水性地吸附。此时，认为由于LAL中的蛋白质和微粒的结合、吸附反应需要长时间，在微粒或使用的试剂类、水等中微量混有的内毒素与蛋白质中的丝氨酸蛋白酶反应，将凝固蛋白原水解为凝固素，结果微粒开始凝聚。并且在此时，认为酶的活化引起试剂中的凝固蛋白原水解而消耗。与此相对，在本专利技术中，在上述规定蛋白质含有丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原时，在结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂中，添加抑制该试剂中的丝氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反应的抑制剂。由此，抑制在试剂的制备过程中的微粒的凝聚，同时抑制酶的活化导致凝固蛋白原水解而消耗。具体地，上述抑制剂可以是已知具有使内毒素失活作用的铁离子或铝离子。另外，也可以是使LAL中的丝氨酸蛋白酶不活化的酶抑制剂。另外，在本专利技术中，将结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂进一步与鲎的血细胞提取物混合，在与上述混合同时或在混合后，可使上述试剂和上述样品混合。由此，相对于结合或吸附蛋白质的微粒分散得到的试剂，可以进一步预先补给LAL中的蛋白质。这样，在与含有内毒素的样品混合时，可以更可靠地使内毒素作用于试剂中的丝氨酸蛋白酶，将结合或吸附在微粒上的凝固蛋白原和混合的LAL中的凝固蛋白原水解，生成凝固素。结果，可以更可靠地使结合或吸附在微粒上的凝固蛋白原之间，或者结合或吸附在微粒上的凝固蛋白原和混合的LAL中的凝固蛋白原聚集，可以促进以微粒为中心的凝聚体的生成。这样，可以在更短的时间进行内毒素的测定。另外，据此，预先纯化LAL中的蛋白质并只提取凝固蛋白原，使其结合或吸附至微粒的情况，或者在上述试剂的制备过程中，添加抑制试剂中的丝氨酸蛋白酶和内毒素的反应的抑制剂的情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
内毒素的测定方法，其是检测样品中的内毒素或测定样品中的内毒素的浓度的内毒素的测定方法，其特征在于，使鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结合或吸附在可分散于试剂中的微粒的表面，使结合或吸附上述蛋白质的上述微粒分散得到的试剂和样品混合，通过检测上述试剂和上述样品的混合液中的凝胶生成，进行内毒素的检测，或通过测定上述凝胶的生成程度，测定内毒素的浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-12-19 2007-3277841.内毒素的测定方法，其是检测样品中的内毒素或测定样品中的内毒素的浓度的内毒素的测定方法，其特征在于，使鲎的血细胞提取物中所含的规定蛋白质结合或吸附在可分散于试剂中的微粒的表面，使结合或吸附上述蛋白质的上述微粒分散得到的试剂和样品混合，通过检测上述试剂和上述样品的混合液中的凝胶生成，进行内毒素的检测，或通过测定上述凝胶的生成程度，测定内毒素的浓度。2.根据权利要求1所述的内毒素的测定方法，其特征在于，上述规定蛋白质是由鲎的血细胞提取物纯化的凝固蛋白原。3.根据权利要求1或2所述的内毒素的测定方法，其特征在于，将结合或吸附上述规定蛋白质的上述微粒分散得到的试剂进一...

【专利技术属性】
技术研发人员：薮崎克己，
申请(专利权)人：兴和株式会社，
类型：发明
国别省市：JP