一种微囊藻毒素生物芯片及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种微囊藻毒素生物芯片及其制备方法与应用，涉及生物芯片领域及基于其的检测方法。将该生物芯片应用于微囊藻毒素的检测。该方法检测限小于1μg/L，可满足WHO对于饮用水和我国地表水环境质量标准中MC‑LR最低含量检测的需求。完成一个样品检测耗时约8min，相比于HPLC和ELISA等传统检测方法，本发明专利技术具有样品前处理简单、实验操作简便、灵敏度高、样品不需要标记、检测成本低、设备简单、对环境无污染等优点，可广泛应用于普通实验室，有望在超市、市场、工厂等需要食品质量实时监控的场所，实现大量样品的现场实时、快速检测。克服了目前生物芯片检测中荧光标记或放射性元素标记污染环境和影响生物活性的问题。

Microcystin biological chip and preparation method and application thereof

The invention discloses a microcystin biological chip and a preparation method and application thereof. The biochip was applied to the detection of microcystins. The detection limit of less than 1 g/L, which can meet the WHO requirements for the detection of drinking water in China and the environmental quality standards for surface water MC LR lowest content. To complete the detection of a sample takes about 8min, compared with the traditional detection methods of HPLC and ELISA, the invention has the advantages of simple sample preparation, experimental operation is simple, high sensitivity, the sample does not require labeling, advantages of low detection cost, simple equipment, no pollution to the environment, and can be widely used in ordinary laboratory, is expected to need time monitoring of food quality in the supermarket, market places and factories, a large number of samples to achieve on-site real-time, rapid detection. The utility model overcomes the problems of environmental pollution and biological activity in the detection of fluorescent markers or radioactive elements.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物芯片领域及基于其的检测方法，特别涉及一种微囊藻毒素（MC-LR）生物芯片及其制备方法与应用。
技术介绍
随着社会工业化的发展，水体富营养化日益严重，蓝藻水华现象频频发生，产生的藻毒素严重威胁人类和动物的健康。蓝藻的次生代谢产物微囊藻毒素（Microcystin，MC）出现频率最高、产生量大且危害最严重。MC能引起神经系统异常症状，如头晕、耳鸣、眩晕、头痛、呕吐、恶心、轻度耳聋、视力障碍和失明等，造成肝脏等多个器官的损伤。在我国长江、黄河、松花江等主要河流以及滇池、上海淀山湖等淡水湖泊中都相继发生蓝藻水华污染现象。微囊藻毒素是一类具有生物活性的单环七肽，分子量900～1200Da，这是一种肝毒素，是肝癌的强烈促癌剂。至今已发现80多种异构体，在淡水环境中存在较多、毒性较强的是微囊藻毒LR，且具有水溶性和耐热性，不挥发，抗pH值变化，在水中的自然降解过程十分缓慢。目前，世界卫生组织（WHO）推荐的饮用水标准和我国地表水环境质量标准中规定MC-LR的标准限量值≦1μg/L。MC-LR的检测常用方法有高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）、酶联免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）、液相色谱—质谱/质谱法（LiquidChromatography-MassSpectrometry/MassSpectrometry，LC-MS/MS）等，这些方法的缺点是样品处理时间长，检测过程烦琐、难于操作，使用放射性元素或标记物而污染环境，仪器价格昂贵且检测成本高，在实际应用中受到限制。基于表面等离子体共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）的生物芯片是一种生物传感器，不需要标记就可对分子间的相互作用进行实时监测，已被广泛用于药物分析、食品分析、环境监测等许多领域。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种微囊藻毒素生物芯片的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的微囊藻毒素生物芯片。该生物芯片是微囊藻毒素衍生物作为探针的。本专利技术的另一目的在于提供上述利用微囊藻毒素生物芯片的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种利用微囊藻毒素生物芯片检测微囊藻毒素的SPR检测方法。通过本专利技术，可以用便携式SPR仪实现样品的现场快速检测。本专利技术具有样品前处理简单、实验操作简便、灵敏度高、样品不需要标记、检测成本低、设备简单、对环境无污染等优点，可以广泛应用于普通实验室，有望在超市、市场、工厂等需要食品质量实时监控的场所，实现大量样品的现场实时、快速检测。克服了目前生物芯片检测方法荧光标记或放射性元素标记污染环境和影响生物活性的问题。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种微囊藻毒素生物芯片的制备方法，包括如下步骤：利用金膜产生表面等离子体共振（SPR）响应，在固相载体（镀金膜的玻璃片）固定微囊藻毒素衍生物（MC-LR-BSA）作为生物探针，由P偏振光检测生物芯片探针与样品的反应。为了进一步的实现本专利技术：当检测样品中有与探针匹配的物质时，共振角变化，SPR检测仪记录检测结果，利用软件控制检测过程并分析实验结果。一种微囊藻毒素生物芯片，通过上述制备方法制备得到。所述的微囊藻毒素生物芯片在检测微囊藻毒素中的应用。一种利用微囊藻毒素生物芯片检测微囊藻毒素的SPR检测方法，包括如下步骤：微囊藻毒素分子与过量抗体混合，通入生物芯片表面，检测SPR效应；微囊藻毒素分子和生物芯片表面的探针MC-LR-BSA都可以与混合物中的抗体结合，即微囊藻毒素分子抑制探针MC-LR-BSA（和探针竞争关系）与微囊藻毒素抗体的结合。抗体的分子量较大，抗体与芯片表面的探针结合后，抗原-抗体结合物引起SPR响应值变化大，则样品中微囊藻毒素分子的浓度与SPR响应值的变化成反比。如果样品中微囊藻毒素浓度小，则更多的微囊藻毒素抗体与生物芯片表面探针结合，SPR响应值即共振角的变化大。本专利技术的机理是：微囊藻毒素MC-LR的分子量是995.2，如果生物芯片表面固定抗体，MC-LR能与抗体结合，但对芯片表面附近的折射率影响较小，SPR共振峰的变化小，导致检测限偏高，因此MC-LR分子不适于直接法检测。为了对MC-LR痕量物质检测，提出抑制型SPR生物芯片检测方法。将MC-LR-BSA固定在生物芯片表面，作为生物探针，不同浓度的微囊藻毒素分子与过量抗体混合，各组样品中抗体为固定的工作浓度，静置5min后，通入生物芯片表面，检测SPR效应，分析动力学过程。本研究采用自行开发的便携式表面等离子体共振（SPR）生物芯片检测仪，利用免疫反应的特异性，采用竞争型免疫方法检测微囊藻毒素（MC-LR），分析动力学反应过程，建立标准曲线。与ELISA等方法相比，本研究仪器便携，操作简便，样品前处理简单，特异性强，无需标记，不影响生物活性，无污染，成本低，可进行现场大量样品的实时连续检测和快速筛选，适用于超市、集市、工厂等需要实时检测的场所，进行质量监控。利用SPR进行生物（免疫反应）实验时，一般还要在传感芯片表面固定一种反应物，使其形成分子敏感膜；然后含待测物的样品通过流路系统进入传感芯片，传感芯片上分子间相互作用的情况可由SPR信号（共振波长或者共振角）的改变反映出来，并通过计算机软件将整个反应过程显示和记录下来。图1为Kretschmann型SPR检测仪器的传感芯片的工作示意图和免疫反应实验结果简图。图1（a）中，金膜上用共价交联法固定了配体，当含有匹配的受体的样品流经芯片表面时，亲和反应将分析物（受体）捕获在膜表面，引起折射率的增加，反射光的共振状态也会相应改变；图1（b）为典型的免疫反应响应曲线，通过注入含有待检测物质和不含有待检测物质的缓冲液，可实时监测被分析物结合与解离的过程。如图1（b）所示，随着反应时间（横坐标）的改变，待测样品折射率产生变化，从而引起新的共振波长或者共振角度（纵坐标）。因此，可根据表面等离子体共振时入射光波长或者角度与金属薄膜表面液体折射率的关系来探测生物分子间的相互作用。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：表面等离子体共振生物芯片快速检测微囊藻毒素具有免标记、只需单一抗体、所需样品量少、可迅速给出定量结果、灵敏度高而成本低等优点。针对现有微囊藻毒素（MC-LR）检测方法操作复杂、因标记而污染环境、仪器贵重，不利于现场快速检测等问题，将表面等离子体共振（SPR）生物芯片应用于微囊藻毒素的检测，提出抑制型SPR生物芯片快速检测痕量微囊藻毒素的方法。该方法检测限小于1μg/L，可满足世界卫生组织（WHO）对于饮用水和我国地表水环境质量标准中MC-LR最低含量检测的需求。完成一个样品检测耗时约8min，相比于高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）等传统检测方法，其快速定量是最大的优势。该装置和方法可用于食品质量监控和现场实时检测。附图说明图1是Kretschmann型SPR检测仪器的原理图；（a）SPR传感芯片工作示意图；（b）免疫反应结果简图。图2是MC-LR表面等离子体共振免疫检测示意图。图3是抗体与生物探针免疫反应的动力学曲线。图4是生物芯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微囊藻毒素生物芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：利用金膜产生表面等离子体共振响应，在固相载体固定微囊藻毒素衍生物作为生物探针，由P偏振光检测生物芯片探针与样品的反应。

【技术特征摘要】
1.一种微囊藻毒素生物芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：利用金膜产生表面等离子体共振响应，在固相载体固定微囊藻毒素衍生物作为生物探针，由P偏振光检测生物芯片探针与样品的反应。2.根据权利要求1所述的微囊藻毒素生物芯片的制备方法，其特征在于：还包括如下步骤：当检测样品中有与探针匹配的物质时，共振角变化，SPR检测仪记录检测结果，利用软件控制检测过程并分析实验结果。3.根据权利要求1或2所述的微囊藻毒素生物芯片的制备方法，其特征在于：所述的固相载体为镀金膜的玻璃片。4.一种微囊藻毒素生物芯片，其特征在于通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。5.权利要求4所述的微...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莹，钟金钢，赵明路，齐攀，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44