治疗性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了对CD44基因(CD44v6或CD44v9)的变体外显子v6或v9中的表位具有特异性的抗体或其抗原结合片段，其抗体药物偶联物(ADC)，以及包含抗体或其抗原结合片段的其他衍生物。本发明专利技术还提供了编码该保护客体(抗体或其抗原结合片段，其抗体药物偶联物(ADC)，以及包含抗体或其抗原结合片段的其他衍生物)的核酸分子及其制备方法。本发明专利技术进一步提供了包含该保护客体的药物组合物，以及其在治疗疾病或在制备用于治疗疾病(如癌症)的药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗性抗体及其应用
技术介绍
CD44是涉及同型细胞、细胞-基质和细胞-细胞骨架相互作用的跨膜糖蛋白家族。CD44的细胞外结构域结合了许多基质取代基：透明质酸、埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)、膜突蛋白(moesin)和分生蛋白(merlin)、肝素亲和生长因子、血管内皮生长因子、p185HER2、表皮生长因子和肝细胞生长因子。其胞内结构域与细胞骨架取代基锚蛋白结合，从而决定细胞和组织的结构形式(Bourguignonetal.,1998,Front.Biosci.3:D637-649；Welchetal.,1995,J.Cell.Physiol.164:605-612)。CD44基因定位于11号染色体，包含20个外显子，跨度为60kb，可细分为5个结构域。20个外显子中的10个，外显子1-5和16-20，构成了CD44(CD44s或CD44std)的标准形式。尽管这种最小的CD44亚型(CD44s)在包括上皮细胞的不同组织中普遍表达，但某些CD44剪接变体(CD44v，CD44var)仅在上皮细胞的一个子集中表达。CD44变体是在信使核糖核酸(mRNA)水平上通过选择性剪接产生的，其方式是蛋白质的细胞外部分的十个外显子(v1-v10)的序列在CD44s中被完全切除，但可以在不同组合的较大变体中出现(Screatonetal.,1992；etal.,1993；Hofmannetal.,1991)。所述变体的不同之处在于不同的氨基酸序列被插入到蛋白质的细胞外部分的某个特定位点。理论上，CD44变体(CD44v)亚型有超过1000种潜在的肽域组合。所有变体的外显子的内含物将产生分子量为230kD的蛋白质，但是大部分变体的亚型小于120kD。变体亚型(CD44v1-10)包括一个或多个拼接的外显子6-15，虽然在人体中，但是外显子6(v1)并未表达。一些剪接变体由正常上皮细胞以组织特异性方式表达。例如，CD44v10由正常淋巴细胞表达(Okamotoetal.,1998,J.Natl.CancerInst.90:307-315)。然而，最近已经表明，某些CD44变体的表达对于引起非转移性大鼠胰腺腺癌细胞系和非转移性大鼠纤维肉瘤细胞系的所谓自发转移行为是必要的和充分的(Günthertetal.,1991)。所述变体可以在多种人类肿瘤细胞以及人类肿瘤组织中检测到。例如，Okamoto等人(Okamotoetal.,2002,Am.J.Pathol.160:441-447；Okamotoetal.,2001,J.Cell.Biol.155:755-762；Murakamietal.,2003,Oncogene22:1511-1516)已经表明，在几种人类肿瘤(不包括前列腺癌)中，25-30kD的裂解产物可通过使用抗CD44细胞质部分的抗体的免疫印迹(Westernblot)检测到。CD44的可溶部分在血清中被检测为100-160-kD片段，所述检测方法为使用抗CD44v单克隆抗体对分子的细胞外部分进行检测(Gansaugeetal.,1997,Cancer80:1733-1739)。流入循环的CD44亚型的免疫印迹检测可作为恶性肿瘤的诊断检测或预后检测(Tayloretal.,1996,J.Soc.Gynecol.Invest.3:289-294)。然后可以开发一种酶联血清免疫测定法(ELISA)，用于灵敏、简便的进行蛋白质检测。CD44v6的扩增与胰腺癌的转移表型(RallandRustgi,1995,CancerRes.55:1831-1835)和乳腺癌增加的等级有关(Woodmanetal.,1996,Am.J.Pathol.149:1519-1530；Bourguignonetal.,1999,CellMotil.Cytoskeleton43:269-287)。在许多良性肿瘤和癌症组织中的单个或连续变体外显子的内含物通过RT-PCR和测序技术进行描述(Okamotoetal.,1998,J.Natl.CancerInst.90:307-315；Okamotoetal.,2002,Am.J.Pathol.160:441-447；RallandRustgi,1995,CancerRes.55:1831-1835；Woodman,etal.,1996,Am.J.Pathol.149:1519-1530；Bourguignonetal.,1999,CellMotil.Cytoskeleton43:269-287；Rocaetal.,1998,Am.J.Pathol.153:183-190；Franzmannetal.,2001,Otolaryngol.HeadNeckSurg.124:426-432；Terpeetal.,1996,Am.J.Pathol.148:453-463；Christetal.,2001,J.Leukoc.Biol.69:343-352；Morteganietal.,1999,Am.J.Pathol.154:291-300；Miyakeetal.,1998,Int.J.Cancer.18:560-564；Yamaguchietal.,1996,J.Clin.Oncol.14:1122-1127)。在转移过程中，肿瘤细胞脱离原发部位，迁移到细胞外基质中，并侵入血管和淋巴管。转移部位的肿瘤生长需要通过黏附蛋白(如CD44)附着到新的细胞外基质上。这与许多癌症已经解除了对CD44基因剪接的管制，导致可能在转移中起一定作用的新CD44变体亚型的表达这一事实相一致。事实上，最近已经研究了结直肠癌发生期间CD44变体的表达(Heideretal.,1993a)。CD44变体的在正常人结肠上皮中不表达，并且在隐窝的增殖细胞中仅检测到了弱表达。在肿瘤发展的后期，例如在腺癌中，所有的恶性肿瘤都表达CD44的变体。CD44变体的高水平组织表达也显示在侵袭性非霍奇金淋巴瘤中(Koopmanetal.,1993)。外显子v6似乎起着特殊的作用，尤其是在转移扩散的过程中(Rudyetal.,1993)。在动物模型中，针对v6特异性表位的抗体可以阻止转移细胞的沉降和转移的生长(Seiteretal.,1993)。在结肠癌中，v6表达与肿瘤进展相关(Wielengaetal.,1993)。在胃癌中，v6表达是区分肠型肿瘤和弥漫型肿瘤的重要诊断标志(Heideretal.,1993b)。在后两个出版物中，使用针对v6特异性表位的抗体测定了v6的表达。因为CD44v6已被证明是在人体肿瘤和正常组织中具有良好表达模式的肿瘤相关抗原(Heideretal.,1995；Heideretal.,1996)，因此其已经应用于基于抗体的诊断性和治疗性方法中(Heideretal.,1996；WO95/33771；WO97/21104)。另一方面，CD44v9的异常表达已被证明与胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌和头颈部鳞状细胞癌有关(US20170137810A1)。CD44v6和CD44v9在先均被证明在结肠癌中有过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有分离的CD44v6表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位包括/实质上由SEQ ID NO:19(例如，由SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的N端上的1或2个残基，SEQ ID NO:19加上SEQ ID NO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQ IDNO:19加上SEQ ID NO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQ ID NO:19组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v6表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v6表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种具有分离的CD44v6表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位包括/实质上由SEQIDNO:19(例如，由SEQIDNO:19加上SEQIDNO:19的N端上的1或2个残基，SEQIDNO:19加上SEQIDNO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQIDNO:19加上SEQIDNO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQIDNO:19组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v6表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v6表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。


2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：
(1)重链可变区(HCVR)，其包括SEQIDNO:1的HCVRCDR1序列、SEQIDNO:2的HCVRCDR2序列和SEQIDNO:3的HCVRCDR3序列；
(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQIDNO:10的LCVRCDR1序列、SEQIDNO:11的LCVRCDR2序列和SEQIDNO:12的LCVRCDR3序列。


3.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位是SEQIDNO:19。


4.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位实质上由SEQIDNO:19组成(例如，由SEQIDNO:19加上SEQIDNO:19的N端上的1或2个残基，SEQIDNO:19加上SEQIDNO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQIDNO:19加上SEQIDNO:19的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。


5.根据权利要求4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v6表位是SEQIDNO:24(HEGYRQTPKEDS)。


6.根据权利要求2-5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述HCVR进一步包含SEQIDNOs:7-9中的一个或多个；和/或
(ii)所述LCVR进一步包括SEQIDNOs:13-18中的一个或多个。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v6表位或具有所述CD44v6表位的细胞结合，其KD为约10nM、约5nM或约2nM或更小。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。


10.一种具有对分离的CD44v9表位特异性的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位包含/实质上由SEQIDNO:43(例如，由SEQIDNO:43加上SEQIDNO:43的N端上的1或2个残基，SEQIDNO:19加上SEQIDNO:43的C端上的1或2个残基，或者SEQIDNO43加上SEQIDNO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)组成，或者由SEQIDNO:43组成；优选的，所述抗体或其抗原结合片段针对所述分离的CD44v9表位，或者针对融合蛋白或其化学偶联物，所述化学偶联物包括所述分离的CD44v9表位和载体蛋白(例如白蛋白，优选BSA或卵清蛋白，或匙孔血蓝蛋白(KLH))。


11.根据权利要求10所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：
(1)重链可变区(HCVR)，其包括SEQIDNO:25的HCVRCDR1序列、SEQIDNO:26的HCVRCDR2序列和SEQIDNO:27的HCVRCDR3序列；
(2)轻链可变区(LCVR)，包括SEQIDNO:34的LCVRCDR1序列、SEQIDNO:35的LCVRCDR2序列和SEQIDNO:36的LCVRCDR3序列。


12.根据权利要求10或11所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位是SEQIDNO:43。


13.根据权利要求10或11所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位实质上由SEQIDNO:43组成(例如，由SEQIDNO:43加上SEQIDNO:43的N端上的1或2个残基，SEQIDNO:43加上SEQIDNO:19的C端上的1或2个残基，或者SEQIDNO:43加上SEQIDNO:43的N端和C端上的1或2个残基组成的表位)。


14.根据权利要求13所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述CD44v9表位是SEQIDNO:44(SHEGLEEDKDH)。


15.根据权利要求11-14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述HCVR进一步包含SEQIDNOs:28-33中的一个或多个；和/或
(ii)所述LCVR进一步包括SEQIDNOs:37-42中的一个或多个。


16.根据权利要求10-15中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述CD44v9表位或具有所述CD44v9表位的细胞结合，其KD为约10nM、约5nM、约2nM、约1nM或更小。


17.根据权利要求10-16中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植抗体或表面重建抗体。


18.根据权利要求10-17中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微抗体、F(ab')3、四体、三体、双体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。


19.一种多肽，其包含权利要求1-9中任一项所述的HCVR和/或LCVR。


20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白(如嵌合抗原T细胞受体)。


21.一种多肽，其包含权利要求10-18中任一项所述的HCVR和/或LCVR。


22.根据权利要求21所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白(如嵌合抗原T细胞受体)。


23.一种编码权利要求19或20中多肽的多核苷酸。


24.一种编码权利要求21或22中多肽的多核苷酸。


25.一种包含权利要求23中多核苷酸的载体。


26.根据权利要求25所述的载体，其中所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。


27.一种包含权利要求24中多核苷酸的载体。


28.根据权利要求27所述的载体，其中所述载体是表达载体(例如，哺乳动物表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或细菌表达载体)。


29.一种细胞，其包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含权利要求19或20中的多肽，包含权利要求23中的多核苷酸，或权利要求25或26中的载体。


30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞对权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽进行表达。


31.根据权利要求29或30所述的细胞，其中所述细胞是BHK细胞、CHO细胞或COS细胞。


32.根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽。


33.根据权利要求32所述的细胞，其中所述细胞是携带嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)，所述嵌合抗原受体包含权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中的多肽。


34.一种细胞，其包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，包含权利要求21或22中的多肽，包含权利要求24中的多核苷酸，或权利要求27或28中的载体。


35.根据权利要求34所述的细胞，其中所述细胞对权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽进行表达。


36.根据权利要求34或35所述的细胞，其中所述细胞是BHK细胞、CHO细胞或COS细胞。


37.根据权利要求34所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽。


38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述细胞是携带嵌合抗原受体(CAR-T细胞)的T细胞，所述嵌合抗原受体包含权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中的多肽。


39.一种生产权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求19或20中多肽的方法，包括：
(a)培养权利要求29、30或31中的细胞；和；
(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原结合片段或多肽。


40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。


41.一种生产权利要求10-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求21或22中多肽的方法，包括：
(a)培养权...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟逊，包建新，侯冰，
申请(专利权)人：艾比玛特医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31