可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种单克隆抗体，尤其为一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，包括其工艺包括如下步骤：S1，蛋白QC；S2，动物免疫；S3，血清检测和筛选；S4，融合及筛选；S5，亚克隆及筛选；S6，抗体上清制备；S7，抗体验证。本发明专利技术的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体具有高亲和力，高特异性，多应用场景等特点，并且可应用于活细胞富集。

【技术实现步骤摘要】
可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体
本专利技术涉及一种单克隆抗体，尤其是一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体。
技术介绍
CD142是一种跨膜单链糖蛋白，与称为II型细胞因子受体的蛋白质家族有关。该受体家族的成员被细胞因子激活。细胞因子是可以影响白细胞行为的小蛋白。还发现VIIa与TF的结合开始细胞内的信号传导过程。TF/VIIa的信号传导功能在血管生成和细胞凋亡中发挥作用。促炎和促血管生成反应通过蛋白酶激活的受体2(PAR2)的TF/VIIa介导的裂解而激活。[8]Eph酪氨酸激酶受体(RTK)家族的EphB2和EphA2也可以被TF/VIIa裂解。CD142参与妊娠早期胎盘发育，与滋养细胞增殖分化及凋亡有关，目前市场上鲜有以CD142作为靶标载体的抗体类产品，并且都没有数据表明可以用于活肿瘤细胞富集。同时对于该研究领域缺乏有效的抗体工具。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一个靶向蛋白研究的工具，对不同癌症患者、癌症不同分期的蛋白表达变化及蛋白网络图谱的更深层次研究得以实现。本专利技术采用的技术方案如下：一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其工艺包括如下步骤：S1，蛋白QC：采购商业化蛋白；S2，动物免疫：选取6只Balb/c小鼠进行抗原免疫，并监测其血清效价以决定最优的免疫小鼠，初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度，筛选出滴度合格的小鼠冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强至滴度最高后融合；S3，血清检测和筛选：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度，确定其血清效价合格；S4，融合及筛选：取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养，收集所有孔的上清，用ELISA对免疫蛋白进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清，用ELISA检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的蛋白结合，以进行亲和力排序，每个融合选免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆；S5，亚克隆及筛选：通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，ELISA检测每个孔上清针对免疫抗原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；S6，抗体上清制备：将最后获得的单克隆细胞株，通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产，产生的腹水用ProteinA/G纯化，并用于后续检测；S7，抗体验证：对获得的单克隆抗体细胞株进行ELISA，Westernblotting，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述S2中Balb/c小鼠为8-12周龄的Balb/c小鼠。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述S3中血清效价合格线为血清效价大于10K。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述S4中的融合工艺为优化过的PEG融合。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述S4中4块384孔板上每孔细胞为102～104。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述S7中的ELISA验证具体为：取待检测的抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，进行PBS洗涤后4℃保存待用；再进行抗原孵育，PBS洗涤，同时设置对照，加入His-HRP,TMB显色反应，酶标仪读数。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述S7中的抗体芯片具体为：使用芯片点样仪将抗-CD142抗体及对照抗体点制于以NC膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点，将A375的全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时，PBS轻柔清洗三遍，再用CY3-SA荧光二抗进行孵育，PBS清洗三遍，使用GenePix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。作为本专利技术的一种优选技术方案：所述的小鼠抗细胞表面糖蛋白CD142的单克隆抗体可变区测序结果为：VHF1EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSVHCDR1GFTFTEYHVHF2MSWVRQPPGKALEWLGFVHCDR2IRNRANGYTTVHF3EYSASVKGRFTISRDNSQNILYLQMNTLRTEDSATYYCVHCDR3ARLTMVVAEFDYVHF4WGQGTTLTVSSVLF1DIQMTQSPSSLSASLGGEVTITCKASVLCDR1QDINKYVLF2IAWYQHKPGKGPRLLIHVLCDR2YTSVLF3TLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSVSNLEPEDIATYYCVLCDR3LQYDNLLTVLF4FGAGTKLELK。本专利技术的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体具有高亲和力，高特异性，多应用场景等特点，并且可应用于活细胞富集。附图说明图1为本专利技术优选实施例中抗体流式细胞术结果图；图2为本专利技术优选实施例中癌细胞杀伤结果图；图3为本专利技术优选实施例中抗体芯片检测实验结果图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。参照图1，本专利技术优选实施例提供了一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其工艺包括如下步骤：S1，蛋白QC：采购商业化蛋白；具体的，在本实施例中采购的为义翘神州公司的货号：13133-H08H的蛋白。S2，动物免疫：选取6只Balb/c小鼠进行抗原免疫，并监测其血清效价以决定最优的免疫小鼠，初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度，筛选出滴度合格的小鼠冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强至滴度最高后融合；具体的，优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原的高亲和力的抗体(IgG亚型)。S3，血清检测和筛选：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度，确定其血清效价合格；S4，融合及筛选：取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其特征在于：其工艺包括如下步骤：/nS1，蛋白QC：采购商业化蛋白；/nS2，动物免疫：选取6只Balb/c小鼠进行抗原免疫，并监测其血清效价以决定最优的免疫小鼠，初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度，筛选出滴度合格的小鼠冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强至滴度最高后融合；/nS3，血清检测和筛选：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度，确定其血清效价合格；/nS4，融合及筛选：取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养，收集所有孔的上清，用ELISA对免疫蛋白进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清，用ELISA检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的蛋白结合，以进行亲和力排序，每个融合选免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆；/nS5，亚克隆及筛选：通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，ELISA检测每个孔上清针对免疫抗原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；/nS6，抗体上清制备：将最后获得的单克隆细胞株，通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产，产生的腹水用Protein A/G纯化，并用于后续检测；/nS7，抗体验证：对获得的单克隆抗体细胞株进行ELISA，Western blotting，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。/n...

【技术特征摘要】
1.一种可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其特征在于：其工艺包括如下步骤：
S1，蛋白QC：采购商业化蛋白；
S2，动物免疫：选取6只Balb/c小鼠进行抗原免疫，并监测其血清效价以决定最优的免疫小鼠，初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度，筛选出滴度合格的小鼠冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强至滴度最高后融合；
S3，血清检测和筛选：免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度，确定其血清效价合格；
S4，融合及筛选：取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，融合细胞铺到4块384孔板上，进行培养，收集所有孔的上清，用ELISA对免疫蛋白进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养，生长几天后，收集所有孔的上清，用ELISA检测与可溶片段检测原的反应，阳性孔进一步检测不同稀释度的蛋白结合，以进行亲和力排序，每个融合选免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆；
S5，亚克隆及筛选：通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞，细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部，ELISA检测每个孔上清针对免疫抗原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆，重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株，经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备；
S6，抗体上清制备：将最后获得的单克隆细胞株，通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产，产生的腹水用ProteinA/G纯化，并用于后续检测；
S7，抗体验证：对获得的单克隆抗体细胞株进行ELISA，Westernblotting，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。


2.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其特征在于：所述S2中Balb/c小鼠为8-12周龄的Balb/c小鼠。


3.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其特征在于：所述S3中血清效价合格线为血清效价大于10K。


4.根据权利要求1所述的可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗细胞单链跨膜糖蛋白CD142的单克隆抗体，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟逊，
申请(专利权)人：普众发现医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31