与烯烃-或炔烃-硫代膦酸酯和-膦酸酯的化学选择性巯基偶联制造技术

本发明专利技术公开了新的偶联物及其制备方法。一种用于制备烯烃‑或炔烃‑硫代膦酸酯和‑膦酸酯的方法，包括如下步骤：使式(I)的化合物与式(II)的含巯基的分子反应，其中

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与烯烃-或炔烃-硫代膦酸酯和-膦酸酯的化学选择性巯基偶联
技术介绍
化学选择性反应和生物正交反应已经成为蛋白质位点特异性修饰的有力工具(Hackenberger,C.P.R.；Schwarzer,D.Angew.Chemie-Int.Ed.2008,47(52),10030；Spicer,C.D.；Davis,B.G.Nat.Commun.2014,5,4740)。通过这些反应，可以得到各种蛋白质-和抗体-偶联物，它们携带功能性模块，这些功能性模块如荧光团和其它光谱标记、聚合物、毒素以及类似翻译后蛋白修饰的小分子和蛋白质。因此，从蛋白质生物学功能研究和发展新的成像技术，到前景光明的新诊断医学手段、基于蛋白质的药物设计和药物的靶向递送，化学选择性的蛋白质修饰技术极大地促进了这些基础研究。近年来，研究人员主要关注修饰蛋白质的生物正交反应工程中的两个不同方面(Sletten,E.M.；Bertozzi,C.R.Angew.Chemie-Int.Ed.2009,48(38),6974)。一方面，很多努力致力于快速反应，此类快速反应需要高反应性起始原料用于蛋白质侧链中存在的独特功能的转化(Patterson,D.M.；Nazarova,L.A.；Prescher,J.A.ACSChem.Biol.2014,9(3),592；Lang,K.；Chin,J.W.ACSChem.Biol.2014,9(1),16)。伴随着这种方法出现的还有实现位点特异性标记的高级琥珀抑制技术，从而产生了许多基因编码的、高反应性的生物正交报告器(reporter)来经历各种类型的环加成反应，包括应变促进的炔烃-叠氮化物环加成或逆需求的狄尔斯-阿尔德反应(inverse-demandDiels-Alderreaction)(Nikic,I.；Plass,T.；Schraidt,O.；Szymaski,J.；Briggs,J.A.G.；Schultz,C.；Lemke,E.A.Angew.Chemie-Int.Ed.2014,53(8),2245；Agard,N.J.；Prescher,J.A.；Bertozzi,C.R.J.Am.Chem.Soc.2004,126(46),15046)。另一方面，研究人员已经专注于开发和应用高收率的蛋白修饰反应，特别是当需要大量功能性蛋白偶联物和理想的定量转化以避免繁琐的纯化步骤(1)时。为了实现这一目标，蛋白质表达方面的高收率尤为重要。由于琥珀抑制可导致低含量表达的蛋白质，标准和营养缺陷表达系统往往是优选的。结合标准蛋白表达实现位点特异性标记的常用方案是将独特的半胱氨酸(Cys)残基通过位点定向诱变放置在选择的蛋白质中，随后进行半胱氨酸修饰策略(Chalker,J.M.；Bernardes,G.J.L.；Lin,Y.A.；Davis,B.G.Chem.-AnAsianJ.2009,4(5),630)。或者，可以利用营养缺陷表达系统引入含叠氮-或炔烃-的氨基酸(Hoesl,M.G.；Budisa,N.Angew.Chemie-Int.Ed.2011,50(13),2896)，可以使用施陶丁格(Staudinger)连接和铜催化叠氮-炔烃环加成(CuAAC)对这些氨基酸进行修饰(Artner,L.M.；Merkel,L.；Bohlke,N.；Beceren-Braun,F.；Weise,C.；Dernedde,J.；Budisa,N.；Hackenberger,C.P.R.Chem.Commun.2012,48(4),522；vanKasteren,S.I.；Kramer,H.B.；Jensen,H.H.；Campbell,S.J.；Kirkpatrick,J.；Oldham,N.J.；Anthony,D.C.；Davis,B.G.Nature2007,446(7139),1105)。虽然这两个方面近年来都已经取得了显著进展，但是对于无金属的化学选择性修饰反应，高反应性和复杂功能性模块的通用和模块化可得性仍然往往是具有挑战性的。这是由于合成反应性构建模块时需要另外的基团保护操作，由于所用的功能性基团的高反应性和不稳定性，该操作可能会出现问题。例如，合成一种用于分子成像的携带Xe-隐黄素的高反应性含环辛烷的荧光肽，需要利用操作繁琐且产率低的正交保护基团(Witte,C.；Martos,V.；Rose,H.M.；Reinke,S.；Klippel,S.；L.；Hackenberger,C.P.R.Angew.Chemie-Int.Ed.2015,54(9),2806)。以往的Cys残基偶联技术主要依赖马来酰亚胺偶联。然而，马来酰亚胺偶联物往往是不稳定的，特别是在高浓度硫醇下，其往往容易水解并发生巯基交换。关于Cys偶联技术的最新综合性综述参见Gunnoo,S.B.；Madder,A.；ChemBioChem.2016,17,529-553。作为可选的偶联方法，WO2015/169784公开了一种用于制备C2-二硫化物桥联肽和蛋白质的方法，其中桥联是通过与炔烃的巯基-炔-反应来实现的。US2535174描述了饱和脂肪族硫醇和乙烯磷酸的酯的碱催化加成反应。J.Bertran-Vicente等人，NatureComm.2016,7,DOI:10.1038/ncomms12703描述了一种序列，其中被保护的亚磷酸首先与亲电子二硫化物反应以生成硫代磷酸酯，该硫代磷酸酯在(例如通过UV光或碱)脱保护时产生磷酸化的半胱氨酸。该方法已应用于天然存在的磷酸化半胱氨酸肽的合成。本专利技术的目的是提供制备偶联物的其他方法，并提供其它偶联物。专利技术详述定义本领域技术人员知晓，在本申请中使用的术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可根据情况指“一(1)个/种”“一(1)个/种或多个/种”或“至少一(1)个/种”。卤素，除非另有定义：指第7主族元素，优选氟、氯、溴和碘，更优选氟、氯和溴，并且当与镁(Mg)组合时甚至更优选溴。烷基，除非别处另有定义：指具有优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-碳原子的饱和直链或支链烃基。例如：甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基，等。烯基，除非别处另有定义：指具有双键的不饱和直链或支链烃基。烯基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯基。例如：乙烯基、1-丙烯基、3-丁烯基，等。炔基，除非别处另有定义：指具有三键的不饱和直链或支链烃基。炔基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-炔基。例如：乙炔基、1-丙炔基，等。烷氧基(烷基自由基-O-)，除非别处另有定义：指通过氧原子(-O-)连接到基本结构上的烷基自由基。烷氧基优选(C1-C8)-、(C1-C6)-或(C1-C4)-烷氧基。例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基，等。类似地，除非别处另有定义，烯氧基和炔氧基分别是通过-O-连接到基本结构上的烯基自由基和炔基自由基。烯氧基优选(C2-C8)-、(C2-C6)-或(C2-C4)-烯氧基。炔氧基优选(C3-C10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于制备硫代膦酸酯或膦酸酯的方法，其包括如下步骤：/n使式(I)的化合物/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180307 EP 18160384.61.用于制备硫代膦酸酯或膦酸酯的方法，其包括如下步骤：
使式(I)的化合物



其中，

代表双键或三键；
当为三键时，X代表R3-C；
当为双键时，X代表(R3R4)C；
Y代表S或O；
R1代表任选取代的脂肪族或芳族残基；
R3代表H或C1-C8-烷基；
R4代表H或C1-C8-烷基；和
●代表脂肪族或芳族残基；
与式(II)的含巯基的分子反应



其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环系统；
得到式(III)的化合物



其中，若式(I)的化合物中代表双键，则代表单键；或
若式(I)的化合物中代表三键，则代表双键；和

●、R1、X和Y如上定义。


2.根据权利要求1所述的方法，其中代表双键，X代表(R3R4)C，R3和R4独立地代表H或C1-C8-烷基以及代表单键。


3.根据权利要求1所述的方法，其中代表三键，X代表R3-C，R3代表H或C1-C8-烷基以及代表双键。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Y为S。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括式(I)的化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV)的化合物



其中R1、X、Y、和●如前述权利要求中任一项所定义；
与诸如如叔丁基过氧化氢(tBu-OOH)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢(H2O2)、碘(I2)、过氧硫酸钾或氧气(O2)的氧化剂反应，以生成式(I)的化合物。


6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括式(IV)的化合物的制备，所述制备包括：
使三卤化磷(X)，优选PCl3依次与(i)R1–OH(XI)；(ii)其中R2独立地代表C1-C8-烷基；(iii)其中Hal代表选自Cl、Br和I的卤素，优选地为Br；和(iv)●-YH(XIV)反应以生成式(IV)的化合物；
其中R1、X、Y、和●如前述权利要求中任一项所定义。


7.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括式(I)的化合物的制备，所述制备包括：
使式(V)的化合物



与式(VIa)或(VIb)的化合物反应以生成式(I)的化合物；



其中EWG代表吸电子基团，优选地，所述吸电子基团选自其中#表示S的位置；Hal代表选自Cl、Br和I的卤素，优选地为Cl；和
其中R1、X、和●如前述权利要求中任一项所定义。


8.根据权利要求7所述的方法，其中为双键，和X代表(R3R4)C，其中R3和R4如前述权利要求中任一项所定义。


9.用于制备硫代膦酸酯或膦酸酯的方法，其包括如下步骤：
使式(I*)的化合物



其中，
V代表C1-C8-烷基，优选地为甲基、乙基或丙基，更优选地为甲基；
X代表(R3R4)C；
其中●、Y、R1、R3和R4如前述权利要求中任一项所定义；
与式(II)的含巯基的分子反应



其中如前述权利要求中任一项所定义；
得到式(III*)的化合物



其中●、V、R1、X和Y如前述权利要求中任一项所定义。


10.根据权利要求9所述的方法，其中Y为S。


11.根据权利要求9或10所述的方法，其进一步包括式(I*)的化合物的制备，所述制备包括：
使式(IV*)的化合物



其中X代表(R3R4)C，和Y、R1、R3、R4、V和●如前述权利要求中任一项所定义；
与诸如如叔丁基过氧化氢(tBu-OOH)、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢(H2O2)、碘(I2)、过氧硫酸钾或氧气(O2)的氧化剂反应，以生成式(I*)的化合物。


12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括式(IV*)的化合物的制备，所述制备包括：
使三卤化磷(X)，优选PCl3依次与(i)R1–OH(XI)；(ii)其中R2独立地代表C1-C8-烷基；(iii)其中Hal代表选自Cl、Br和I的卤素，优选地为Br，和X代表(R3R4)C；和(iv)●-YH(XIV)反应以生成式(IV*)的化合物；
其中R1、R3、R4、V、Y和●如前述权利要求中任一项所定义。


13.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括式(I*)的化合物的制备，所述制备包括：
使式(V*)的化合物



与式(VIa)或(VIb)的化合物反应以生成式(I*)的化合物；



其中EWG代表吸电子基团，优选地，所述吸电子基团选自其中#表示S的位置；Hal代表选自Cl、Br和I的卤素，优选地为Cl；和
其中X代表(R3R4)C，和R1、R3、R4、V和●如前述权利要求中任一项所定义。


14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R1代表任选地被如下的至少一个取代的C1-C8-烷基：其中n为1、2、3、4、5或6的(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2、-N3、-N(C1-C8-烷基)2、＝O、C3-C8-环烷基、-S-S-(C1-C8-烷基)、其中n为1、2、3、4、5或6的羟基-(C1-C8-烷氧基)n、C2-C8-烯基、C2-C8-炔基；或
R1代表任选独立地被如下的至少一个取代的苯基：C1-C8-烷基、其中n为1、2、3、4、5或6的(C1-C8-烷氧基)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1-C8-烷基)H、-NH2或-N(C1-C8-烷基)2；或
R1代表诸如吡啶基的5-或6-元杂芳族系统；
优选地，R1代表C1-C8-烷基；被-S-S-(C1-C8-烷基)取代的C1-C8-烷基；被其中n为1、2、3、4、5或6的(C1-C8-烷氧基)n取代的C1-C8-烷基；被任选取代的苯基取代的C1-C8-烷基；或苯基；或被-NO2取代的苯基。


15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R1代表甲基、乙基、丙基或丁基，更优选地为甲基或乙基。


16.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中R1代表
其中R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢或C1-C8-烷基；
和#代表O的位置。


17.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中R1代表被苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被取代，其中Z为O或NH，优选为O，和其中#代表所述苯基的位置。


18.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中R1代表被苯基取代的C1-C8-烷基，所述苯基进一步被取代，和其中#代表所述苯基的位置。


19.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中R1代表其中n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的或其中n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的其中#代表O的位置。


20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中●代表小分子，所述小分子诸如例如任选取代的C1-C8-烷基，优选地为乙基、-CH2-苯基、其中#表示Y的位置；或
●代表任选取代的苯基；或
●代表放射性或非放射性核素、生物素、报告酶、核苷酸、寡核苷酸、诸如CY5或EDANS的荧光团、氨基酸、肽或任选取代的5-或6-元杂芳族系统；其中任选地，所述●进一步包含与Y结合的连接子。


21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中●代表：
生物素；或
●代表CY5或EDANS；或
●代表苯基，所述苯基任选地被独立地选自C1-C8-烷基、C1-C8-烷氧基、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1-C8-烷基)、-N(C1-C8-烷基)2、-COOH、-COO(C1-C8-烷基)、-O-C(O)-(C1-C8-烷基)、-C(O)N-(C1-C8-烷基)、-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)的1、2、3、4或5个取代基取代，优选地，所述苯基任选地被选自C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基)和NO2的1个取代基取代；或
●代表C1-C8-烷基，所述C1-C8-烷基任选地被选自如下的至少一个取代基取代：C3-C8-环烷基；具有3至8个环成员的杂环基，其中杂原子选自N、O、S；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-CONH2；-C(O)N(C1-C8-烷基)2；-C(O)NH-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基)和NO2、苯基或杂芳族系统、单糖、多糖、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、聚合物、氨基酸、荧光团、蛋白质标签(第1代取代基)，其中第1代取代基可再次任选地被如下基团取代：C3-C8-环烷基；具有3至8个环成员的杂环基，其中杂原子选自N、O、S；C1-C8-烷氧基；卤素；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1-C8-烷基)；-N(C1-C8-烷基)2；-COOH；-COO(C1-C8-烷基)；-O-C(O)-(C1-C8-烷基)；-CONH2；-C(O)N(C1-C8-烷基)2；-C(O)NH-(C1-C8-烷基)；-N(H)-C(O)-(C1-C8-烷基)，优选C1-C8-烷氧基、-COOH、-COO(C1-C8-烷基)和NO2、苯基或杂芳族系统(第2代取代基)，和其中第2代取代基可再次被选自相同组的至少一个取代基取代，和其中此类取代可进行至3、4、5、6、7、8、9或10代；或
●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸、寡核苷酸、糖、多糖、聚合物、任选取代的C1-C8-烷基、任选取代的苯基或任选取代的芳族5-或6-元杂环系统；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子；或
●代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


22.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中●代表药物、蛋白质标签或诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素、蛋白质、肽、抗体或寡核苷酸；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


23.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中●代表连接子或连接子-药物偶联物。


24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中代表氨基酸、肽、蛋白质、抗体、核苷酸或寡核苷酸。


25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中代表抗体，优选为IgG抗体，更优选地为西妥昔单抗或曲妥珠单抗或本妥昔单抗；蛋白质，优选GFP蛋白或eGFP蛋白，白蛋白，三肽，优选式(VIII)的肽，或式(IX)的肽，
其中#代表S的位置。


26.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表抗体，和
●代表蛋白质标签或诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


27.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表蛋白质，和
●代表蛋白质标签或诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素、肽、抗体、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


28.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表肽，和
●代表蛋白质标签或诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


29.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表氨基酸，和
●代表蛋白质标签或诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素、肽、蛋白质、寡核苷酸或小分子；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


30.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表抗体，和
●代表连接子、药物或连接子-药物偶联物。


31.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表核苷酸，和
●代表肽、蛋白质、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素或小分子；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


32.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表核苷酸，和
●代表连接子。


33.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表寡核苷酸，和
●代表肽、蛋白质、蛋白质标签、抗体、寡核苷酸、诸如CY5或EDANS的荧光团、生物素或小分子；其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子。


34.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中

代表寡核苷酸，和
●代表连接子。


35.根据权利要求1至22、26至29、31和33中任一项所述的方法，其中
●代表氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸，其中所述氨基酸、肽、核苷酸或寡核苷酸与固体支持物结合，其中任选地所述●进一步包含与Y结合的连接子...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·克里斯蒂安，A·L·鲍曼，MA·卡斯帕，S·拜恩，J·赫尔马斯梅茨，H·莱昂哈特，T·斯托切克，M·格拉克，D·舒马赫，
申请(专利权)人：柏林合作研究学会，路德维希马克西米利安慕尼黑大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE