具有针对T细胞受体beta恒定区的抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)制造技术

本公开涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含选择性结合TCR beta恒定区1(TRBC1)或TRBC2的抗原结合域；细胞；包含此类CAR的此类T细胞；以及此类细胞用于受试者中T细胞淋巴瘤或白血病的治疗的用途。

【技术实现步骤摘要】
具有针对T细胞受体beta恒定区的抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)本申请是基于申请日为2015年3月5日，最早优先权日为2014年3月5日，申请号为201580011306.X，专利技术名称为：“具有针对T细胞受体beta恒定区的抗原结合域的嵌合抗原受体(CAR)”的专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及在T细胞淋巴瘤或白血病的治疗中有用的细胞和试剂。专利技术背景淋巴样恶性肿瘤在很大程度上可以分为来源于T细胞或B细胞的那些。T细胞恶性肿瘤是临床上和生物学上异质性的病症组，总共包括10-20％的非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤和20％的急性白血病。最普遍的经鉴定的病理亚型是外周T细胞淋巴瘤，非特指型(peripheralT-celllymphoma,nototherwisespecified)(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(angio-immunoblasticT-celllymphoma,AITL)和间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma,ALCL)。在所有急性淋巴母细胞白血病(ALL)中，约20％是T细胞表型的。与例如B细胞恶性肿瘤相比，这些状况通常表现为侵袭性的，其中估算的5年存活率为仅30％。在T细胞淋巴瘤的情况下，它们与高比例的呈现播散性疾病(disseminateddisease)的患者，不利的国际预后指标(InternationalPrognosticIndicator)(IPI)评分和结外(extra-nodal)疾病的盛行相关。单独化疗通常不是有效的，且少于30％的患者使用目前的治疗得到治愈。此外，不像B细胞恶性肿瘤，其中免疫疗法例如抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)具有显著改善的结果，目前不存在同等有效的，最低限度毒性的免疫疗法可用于T细胞恶性肿瘤的治疗。开发用于T细胞病症的免疫疗法的重大困难是克隆性和正常T细胞的标志物表达的相当多的重叠，其中没有单个抗原明确地能够鉴定克隆性(恶性)细胞。当靶向全B细胞抗原以治疗B细胞恶性肿瘤时存在相同的问题。然而，在这种情况下，对B细胞区室的伴随的耗竭导致相对轻微的免疫抑制，这是易于被大多数患者忍受的。此外，在导致特别是正常B细胞区室的长期耗竭的疗法中，其丧失可以在很大程度上通过施用汇集的免疫球蛋白来消除。当靶向T细胞恶性肿瘤时，情况完全不同。这里，T细胞区室的伴随耗竭导致严重的免疫抑制和严重的毒性。此外，不存在令人满意的方法来减轻T细胞区室的丧失。毒性部分通过治疗性单克隆抗体阿仑单抗(Alemtuzumab)的临床效果所揭示。该试剂裂解表达CD52的细胞并在T细胞恶性肿瘤中具有一些效力。该试剂的效用被深切的细胞免疫缺陷大大限制，很大程度上由于T细胞的耗竭，伴随着升高的感染风险。因此，对于不与以上缺点相关的，用于T细胞恶性肿瘤的靶向治疗的新方法存在需要。附图简述图1：αβT细胞受体/CD3复合物的示意图。T细胞受体由6种不同的蛋白链形成，其必须在内质网中组装以表达在细胞表面上。CD3复合物的四种蛋白(CD3ζ,CD3γ,CD3ε和CD3δ)覆盖(sheath)T细胞受体(TCR)。该TCR给所述复合物注入对特定抗原的特异性并由两条链组成：TCRα和TCRβ。每条TCR链具有膜远端的可变组分和膜近端的恒定组分。几乎所有的T细胞淋巴瘤和许多T细胞白血病表达TCR/CD3复合物。图2：T细胞受体重排期间T细胞受体β-恒定区(TRBC)-1和TRBC-2的分隔(segregation)。每条TCRbeta链从特定beta可变(V)，多样性(D)，连接(J)和恒定(TRBC)区域的基因组重组形成。人基因组含有两个非常相似且功能上等同的TRBC基因座，称作TRBC1和TRBC2。在TCR基因重排期间，J-区与TRBC1或TRBC2重组。该重排是永久性的。T细胞在它们的表面上表达单个TCR的许多拷贝，因此每个T细胞将表达TCR，其β-链恒定区由TRBC1或TRBV2编码。图3：人TRBC1和TRBC2在氨基酸水平的比对。由TRBC1和TRBC2编码的TCRβ恒定链仅通过4个氨基酸差异而不同：TRBC位置3处的K/N；TRBC位置4处的N/K；TRBC位置36处的F/Y；TRBC位置135处的V/E。图4：明确证明JOVI-1抗体结合TRBC1而不结合TRBC2。细胞的遗传工程用于明确证明JOVI-1单克隆抗体识别TCRβ恒定链的TRBC1变体。生成了三-顺反子逆转录病毒基因盒(tri-cistronicretroviralcassette)。这编码人TCR的TCRα和TCRβ链两者，所述人TCR识别次要组织相容性抗原HA1，以及截短的人CD34作为方便的标志物基因。天然地，HA1TCR是TRBC2。生成了第二逆转录病毒基因盒，除了TCRβ恒定区中的4个残基以外其与第一个相同，所述TCRβ恒定区中的4个残基(其区分TRBC1与TRBC2)改变为由TRBC1编码的那些。使用任一载体转导JurkatT细胞，其的TCRα和TCRβ链两者都被敲除。这些细胞使用全-TCR/CD3抗体或单克隆JOVI-1与针对CD34的抗体联合染色，并在流式细胞仪中分析。上排揭示了使用全-TCR/CD3抗体对CD34(转导的标志物)的染色，下排揭示了使用JOVI-1对CD34的染色。转导的细胞表现出相似的TCR/CD3染色，但仅TRBC1+ve细胞使用JOVI-1染色。因此，JOVI-1对TRBC1是特异性的且进一步使用抗体区分TRBC1和2的TCR是可能的。图5：JOVI-1mAb通过识别TRBC的残基3和4区分TRBC1与TRBC2。为了精确地确定JOVI-1如何区分TRBC1与TRBC2，突变上文详细描述的HA1TCRTRBC2构建体以制备两种TRBC1/2杂交体。生成了另外的变体使得仅TCRβ恒定区的残基3和4从TRBC2的那些改变为TRBC1中存在的那些。制成了进一步的变体，其中仅残基36从TRBC2中存在的改变为TRBC1。使用这些新的构建体转导TCR敲除的JurkatT细胞。图4中描述的初始的TRBC2和TRBC1转导的Jurkat用作对照。JurkatT细胞使用JOVI-1染色并使用流式细胞仪分析。将JOVI-1的染色重叠在非转导的TCR敲除的JurkatT细胞的染色上。JOVI-1染色表达TRBC1TCR而不是TRBC2TCR的Jurkat。JOVI-1染色其中仅TRBC残基3和4是TRBC1的那些残基的TRBC1/2杂交体。JOVI-1不染色其中仅TRBC残基36是TRBC1的残基的JurkatT细胞。图6：TRBC1的正常供体T细胞表达的例子。正常供体外周血单核细胞使用针对CD3、CD4、CD8的抗体和JOVI-1染色并通过流式细胞术分析。CD4+和CD8+T细胞群体示于上组。对该群体的每一个设门和前向散射(forwardscatter)对JOVI-1染色分别示于Y和X轴。这些数据表明CD8+和CD4+区室两者都含有TRBC1+ve本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.缀合的抗体，其选择性结合TCR beta恒定区1(TRBC1)或TRBC2。/n

【技术特征摘要】
20140305 GB 1403905.1;20140925 GB 1416908.01.缀合的抗体，其选择性结合TCRbeta恒定区1(TRBC1)或TRBC2。


2.根据权利要求1的缀合的抗体，其选择性结合TRBC1。


3.根据权利要求1或2中任一项的缀合的抗体，其具有可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述VH和VL包含以下互补决定区(CDR)：
VHCDR1:SEQIDNo.7；
VHCDR2:SEQIDNo.8；
VHCDR3:SEQIDNo.9；
VLCDR1:SEQIDNo.10；
VLCDR2:SEQIDNo.11；和
VLCDR3:SEQIDNo.12。


4.根据权利要求2的缀合的抗体，其包含具有如SEQIDNo.1所示的序列的可变重链(VH)和具有如SEQIDNo.2所示的序列的可变轻链(VL)。


5.根据权利要求2的缀合的抗体，其包含具有如SEQIDNo.3所示的序列的scFv。


6.根据权利要求1的缀合的抗体，其选择性结合TRBC2。


7.根据权利要求1至6中任一项的缀合的抗体，其包含化疗实体。


8.根据权利要求7的缀合的抗体，其中所述化疗实体是细胞毒性药物。


9.根据权利要求1至8中任一项的缀合的抗体在制备用于治疗受试者中T细胞淋巴瘤或白血病的药物中的用途，其包括以下步骤：
将所述缀合的抗体施用至所述受试者，以引起恶性T细胞以及与所述恶性T细胞表达相同TRBC的正常T细胞的选择性耗竭，但不引起表达所述恶性T细胞不表达的TRBC的正常T细胞的耗竭。


10.根据权利要求9的用途，其进一步包括调查来自所述受试者的恶性T细胞的TCRbeta恒定区(TCRB)以确定其表达TRBC1还是TRBC2的步骤。

【专利技术属性】
技术研发人员：M普勒，P马乔西亚，
申请(专利权)人：奥托路斯有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB