细胞制造技术

本发明专利技术涉及细胞，其共表达：(i)在细胞表面的第一嵌合抗原受体(CAR)，其包含与CD19结合的抗原结合域；(ii)在细胞表面的第二CAR，其包含与CD22结合的抗原结合域；(iii)显性阴性SHP2(dSHP2)；和(iv)显性阴性TGFβ受体II(dnTGFβRII)。(dnTGFβRII)。(dnTGFβRII)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞
专利

[0001]本专利技术涉及包含多于一种嵌合抗原受体(CAR)的细胞。
技术背景
[0002]已经描述许多用于癌症治疗的免疫治疗剂，其包括治疗性单克隆抗体(mAb)，免疫缀合mAb，放射缀合mAb和双特异性T细胞接合物。
[0003]通常，这些免疫治疗剂靶向单个抗原：例如，利妥昔单抗(Rituximab)靶向CD20；Myelotarg靶向CD33；和阿仑单抗(Alemtuzumab)靶向CD52。
[0004]人CD19抗原是95kDa的跨膜糖蛋白，其属于免疫球蛋白超家族。CD19在B细胞分化的极早期表达，并且仅在终末B细胞分化成浆细胞时丢失。因此，CD19在除多发性骨髓瘤以外的所有B细胞恶性肿瘤上表达。由于正常B细胞区室的丢失是可接受的毒性，CD19是有吸引力的CAR靶标，并且用CAR靶向CD19的临床研究已经看到有希望的结果。
[0005]Goldie
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Coldman假说提供了肿瘤学领域的特殊问题：该假说描述了由于大多数癌症中固有的高突变率，单个抗原的唯一靶向性可能通过所述抗原的调节而导致肿瘤逃逸。抗原表达的这种调节可能降低已知免疫治疗药物，包括靶向CD19的那些的功效。
[0006]因此，靶向CD19的免疫治疗药物的问题是B细胞恶性肿瘤可能发生突变并变为CD19阴性。这可能导致对CD19靶向治疗药物无响应的CD19阴性癌症的复发。例如，在一项儿科研究中，Grupp等人报告称，在B
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急性淋巴细胞白血病(B
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ALL)的CD19靶向嵌合抗原受体疗法之后的所有复发中的一半是由于CD19阴性疾病(第56届美国血液学会年会和博览会)。
[0007]因此，需要能够靶向多于一个细胞表面结构的免疫治疗剂，以反映与许多癌症，包括CD19阳性癌症，相关联的标志物表达的复杂模式。
[0008]嵌合抗原受体(CAR)
[0009]嵌合抗原受体是将例如单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应器功能的蛋白质。它们通常的形式是I型跨膜域蛋白，其中识别抗原的氨基端、间隔物、跨膜域均与传递T细胞存活和激活信号的复合胞内域连接(参见图1A)。
[0010]这些分子最常见的形式是衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合，这些单克隆抗体识别靶抗原，经由间隔物和跨膜域融合到信号传导胞内域。此类分子响应于scFv对其靶标的识别而导致T细胞的激活。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀伤表达靶抗原的靶细胞。已经开发了针对肿瘤相关抗原的若干CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前正在用于治疗各种癌症的临床试验中。
[0011]已经观察到，使用CAR方法治疗癌症，肿瘤异质性和免疫编辑可以导致从CAR治疗逃逸。例如，在Grupp等人(2013；New Eng.J.Med 368:1509
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1518,paper No 380,ASH 2014)描述的研究中，CAR修饰的T细胞方法用于治疗急性B淋巴细胞性白血病。在该临床试验中，发现在一个月后完全缓解的10名患者确实复发，并且其中5名患者复发了CD19阴性疾病。
[0012]因此，需要解决癌症逃逸和肿瘤异质性问题的替代CAR治疗方法。
[0013]两种CAR结合特异性的表达
[0014]已经开发被称为串联CAR或TanCAR的双特异性CAR，试图同时靶向多个癌症特异性标志物。在TanCAR中，胞外域包含由接头连接的两个串联抗原结合特异性。因此，两个结合特异性(scFv)均与单个跨膜部分连接：一个scFv与膜并列，且另一个处于远端位置。
[0015]Grada等人(2013,Mol Ther Nucleic Acids 2:e105)描述了TanCAR，其包括CD19特异性scFv，然后是Gly
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Ser接头，然后是HER2特异性scFv。HER2
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scFv处于近膜(juxta
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membrane)位置，并且CD19
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scFv处于远端位置。显示Tan CAR诱导对两种肿瘤限制性抗原中的每一种产生不同的T细胞反应性。选择这种排列，是因为HER2(632aa/)和CD19(280aa,)的各自长度适合于该特定的空间排列。还已知HER2 scFv结合HER2最远端的4个环。
[0016]这种方法的问题是，由于远端scFv的存在，特别是它与抗原结合，近膜scFv可能难以接近。鉴于需要选择两个scFv的相对位置，鉴于抗原在靶细胞上的空间排列，可能无法将这种方法用于所有scFv结合对。此外，TanCar方法不太可能用于两个以上的scFv，具有三个或更多scFv的TanCAR将是非常大的分子，并且scFv很可能相互折叠，从而掩盖抗原结合位点。同样令人怀疑的是，与跨膜域相隔两个或更多个scFv的最远端scFv的抗原结合是否能够触发T细胞活化。
[0017]因此，需要替代方法来在细胞，如T细胞，的表面上表达两种CAR结合特异性。该问题已由本专利技术人在WO2016/102965中解决。仍然需要提供在表面上表达两种CAR结合特异性，也表现出改善的存活和持久性的细胞。

技术实现思路

[0018]本专利技术人已经开发出在细胞表面表达两种CAR的CAR T细胞，一种特异性针对CD19并且一种特异性针对CD22。此外，本专利技术的CAR T细胞额外包含增强模块，在本文中对其进行了更详细的描述。
[0019]因此，在第一方面，本专利技术提供了在细胞表面共表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR的细胞，每个CAR包含抗原结合域，其中第一CAR的抗原结合域与CD19结合，第二CAR的抗原结合域与CD22结合，进一步地其中细胞表达显性阴性SHP2(dSHP2)和显性阴性TGFβ受体II(dnTGFβRII)。
[0020]一种CAR结合CD19并且另一种CAR结合CD22的事实是有利的，因为一些淋巴瘤和白血病在CD19靶向后变为CD19阴性(或在CD22靶向后可能变为CD22阴性)，因此如果发生这种情况，它提供了“备用”抗原。此外，本专利技术人已表明，与dSHP2和dnTGFβRII的特定组合是有利的，如本文进一步所描述。
[0021]本专利技术人还已经表明，细胞内信号传导域的特殊组合也是有利的。因此，本专利技术提供了其中每个CAR包含细胞内信号传导域的细胞，其中第一CAR的细胞内信号传导域包括TNF受体家族胞内域；并且第二CAR的细胞内信号传导域包括共刺激胞内域。
[0022]共刺激胞内域可以是CD28共刺激胞内域。合适的TNF受体家族胞内域的实例包括但不限于OX
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40和4
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1BB胞内域。
[0023]第一和第二CAR的细胞内信号传导域也可能包含含有ITAM的胞内域。
[0024]该细胞可能是免疫效应细胞，如T细胞、自然杀伤(NK)细胞或NKT细胞。本文提到的与T细胞相关的特征同样适用于其他免疫效应细胞，如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.细胞，其共表达：(i)在细胞表面的第一嵌合抗原受体(CAR)，其包含与CD19结合的抗原结合域；(ii)在细胞表面的第二CAR，其包含与CD22结合的抗原结合域；(iii)显性阴性SHP2(dSHP2)；和(iv)显性阴性TGFβ受体II(dnTGFβRII)。2.根据权利要求1的细胞，其中每个CAR包含细胞内信号传导域，其中所述第一CAR的细胞内信号传导域包含TNF受体家族胞内域；并且所述第二CAR的细胞内信号传导域包含共刺激胞内域。3.根据权利要求2的细胞，其中所述共刺激域是CD28共刺激胞内域。4.根据权利要求2或3的细胞，其中所述TNF受体家族胞内域是OX
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40或4
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1BB胞内域。5.根据权利要求2、3或4中任一项的细胞，其中所述第一CAR和所述第二CAR的细胞内信号传导域还包含含有ITAM的域。6.根据权利要求1至5中任一项的细胞，其中每个CAR包含：(i)抗原结合域；(ii)间隔物；和(iii)跨膜域；其中所述第一CAR的间隔物与所述第二CAR的间隔物不同。7.根据权利要求6的细胞，其中所述第二CAR的间隔物包含软骨寡聚基质蛋白(COMP)卷曲螺旋域。8.根据权利要求1至7中任一项的细胞，其中所述第一CAR包含CD19结合域，其包含a)重链可变区(VH)，其具有含有以下序列的互补决定区(CDR)：CDR1
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SYWMN(SEQ ID No.1)；CDR2
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QIWPGDGDTNYNGKFK(SEQ ID No.2)；CDR3
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RETTTVGRYYYAMDY(SEQ ID No.3)；和b)轻链可变区(VL)，其具有含有以下序列的CDR：CDR1
–
KASQSVDYDGDSYLN(SEQ ID No.4)；CDR2
–
DASNLVS(SEQ ID No.5)；CDR3
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QQSTEDPWT(SEQ ID No.6)。9.根据权利要求8的细胞，其中所述CD19结合域包含具有如SEQ ID No.7或SEQ ID NO 8所示的序列的VH域；或具有如SEQ ID No 9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的序列的VL域，或其具有至少90％序列同一性的变体，所述变体保留结合CD19的能力。10.根据权利要求9的细胞，其中所述CD19结合域包含如SEQ ID No12、SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示的序列，或其具有至少90％序列同一性的变体，所述变体保留结合CD19的能力。11.根据权利要求1至7中任一项的细胞，其中所述第二CAR包含CD22结合域，其包含a)重链可变区(VH)，其具有含有以下序列的互补决定区(CDR)：CDR1
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NYWIN(SEQ ID No.15)；CDR2
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NIYPSDSFTNYNQKFKD(SEQ ID No.16)；CDR3
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DTQERSWYFDV(SEQ ID No.17)；和
b)轻链可变区(VL)，其具有含有以下序列的CDR：CDR1
–
RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID No.18)；CDR2
–
KVSNRFS(SEQ ID No.19)；CDR3
–
SQSTHVPWT(SEQ ID No.20)。12.根据权利要求11的细胞，其中所述CD22结合域包含具有如SEQ ID No.21或SEQ ID NO 22所示的序列的VH域；或具有如SEQ ID No 23或SEQ ID No.24所示的序列的VL域，或其具有至少90％序列同一性的变体，所述变体保留结合CD22的能力。13.根据权利要求11的细胞，其中所述CD22结合域包含如SEQ ID No25或SEQ ID No.26所示的序列，或其具有至少90％序列同一性的变体，所述变体保留结合CD22的能力。14.根据权利要求1至13中任一项的细胞，其中所述第一CAR具有以下结构：AgB1
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间隔物1
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TM1
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TNF
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ITAM其中：AgB1是所述第一CAR的抗原结合域；间隔物1是所述第一CAR的间隔物；TM1是所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：S斯里瓦斯塔瓦，S科尔多巴，S奥诺哈，S托马斯，M普勒，
申请(专利权)人：奥托路斯有限公司，
类型：发明
国别省市：