工程化免疫细胞制造技术

本发明专利技术涉及工程化免疫细胞，其包含：(i)靶标结合多肽，其包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和(ii)定位多肽，其包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。当靶标结合多肽结合其靶蛋白以及定位多肽时，靶蛋白在细胞表面的表达因为靶蛋白保留在细胞内区室中而减少或消除。消除。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化免疫细胞


[0001]本专利技术涉及控制工程化免疫细胞中靶蛋白表达的方法。特别地，本专利技术涉及通过在细胞内区室中的保留来控制至少两种靶蛋白的表达的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]经典地，表面表达的蛋白质通过信号肽序列被引导至内质网(ER)，并通过一个或多个疏水性螺旋跨膜结构域锚定在ER的膜中。这些蛋白质在ER中折叠并通过分泌途径迁移到细胞表面。
[0004]ER中的一些蛋白质被引导至高尔基体而非分泌途径，因此不在细胞表面表达。多种基序将蛋白质引导至高尔基体。
[0005]最典型的此类基序之一为“SEKDEL”基序。该基序在蛋白质末端羧基末端的表达将蛋白质从ER引导至高尔基体。该基序可用于将通常不会迁移至高尔基体的蛋白质从ER引导至高尔基体。例如，Pelham等人(Methods Enzymol.327,279
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283(2000))描述了具有羧基末端sekdel的单链可变片段(scFv)的表达可以将其同源靶标引导至高尔基体，从而减少或敲除同源靶标的表面表达(参见图1)。
[0006]单结构域抗体片段(dAb)由于其固有的稳定性和简单性，非常适合“SEKDEL敲低”。
[0007]在某些情况下，可能期望多种蛋白质的表面表达的降低。这需要许多不同dAb
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sekdel融合体的共表达。多种转基因蛋白的共表达较为困难，通常需要多次转导(其带有插入诱变的风险)和/或多个内部启动子(其导致启动子干扰和沉默)。此外，诸如内部核糖体进入序列(IRES)的基序会导致下游蛋白质低得多的表达。
[0008]一种替代方法是口蹄疫2A或2A样序列的使用。Donnelly等人(J.Gen.Virol.82,1027
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1041(2001))描述了这些被非常有效地切割的短肽序列。在某些情况下，具有2A肽的单个开放阅读框是表达多种转基因蛋白的唯一方法，因此迄今为止，在某些情况下，2A肽的使用是可以用SEKDEL敲低来敲除多种表面蛋白的唯一方法。
[0009]2A肽的限制是其切割导致2A肽的15
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20个残留碱基(终末脯氨酸除外)保留在转基因蛋白的羧基末端。这些残留碱基可抑制sekdel识别，例如通过当这些残留碱基紧邻SEKDEL细胞内保留信号的C末端时掩蔽SEKDEL基序。
[0010]因此，仍然需要能够减少或敲低多种靶蛋白的方法。
[0011]专利技术概述
[0012]本专利技术人已经开发了一系列能够降低或敲低一种或多种靶蛋白的表达的工程化蛋白质。
[0013]在第一方面，本专利技术提供了工程化免疫细胞，其包含：
[0014](i)靶标结合多肽，其包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和
[0015](ii)定位多肽，其包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。
[0016]该细胞可以包含：
[0017](i)至少两个靶标结合多肽，其中每个靶标结合多肽包含靶标结合结构域和第一
蛋白相互作用结构域；和
[0018](ii)定位多肽，其包含与每个靶标结合多肽的第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。
[0019]至少两个靶标结合多肽可以结合相同的靶蛋白。例如，所述至少两个靶标结合多肽可以结合相同靶蛋白的不同表位。在这方面，两个或更多个靶标结合多肽可以协同发挥作用以引起靶蛋白在细胞内区室中的保留。
[0020]或者，至少两个靶标结合多肽可以结合不同的靶蛋白。在这方面，两个或更多个靶标结合多肽可以独立作用以引起两种或更多种靶蛋白在细胞内区室中的保留。
[0021]细胞内保留信号可以选自下组：高尔基体保留序列；跨高尔基体网络(TGN)回收信号；内质网(ER)保留序列；蛋白酶体定位序列或溶酶体分选信号。
[0022]例如，细胞内保留信号可以选自：
[0023]a)包含选自以下的氨基酸序列的高尔基体保留序列：SEKDEL(SEQ ID NO:1)、KDEL(SEQ ID NO:2)、KKXX(SEQ ID NO:3)、KXKXX(SEQ ID NO:4)，包含序列KYKSRRSFIDEKKMP(SEQ ID NO:5)的腺病毒E19蛋白尾部，包含序列MHRRRSRSCR(SEQ ID NO:6)、KXD/E(SEQ ID NO:7)或YQRL(SEQ ID NO:8)的HLA恒定链片段，其中X为任何氨基酸；和/或
[0024]b)选自以下的内质网保留结构域：核糖体结合糖蛋白I、核糖体结合糖蛋白II、SEC61或细胞色素b5；和/或
[0025]c)包含表1至5中所示的任何序列的细胞内保留信号。
[0026]所述靶标结合结构域或每个靶标结合结构域可以包含单结构域抗体(sdAb)。
[0027]靶蛋白可以是例如CD3/T细胞受体(TCR)复合物的组分、细胞因子、人白细胞抗原(HLA)I类分子、MHC II类分子、下调免疫应答的受体、在T细胞上表达的配体、或调节免疫应答的胞质蛋白。
[0028]靶蛋白可以选自下组：
[0029](i)CD3/TCR复合物的组分，其选自：CD3ε、TCRα、TCRαβ、TCRγ、TCRδ、CD3δ、CD3γ和CD3ζ；
[0030](ii)HLA I类分子，其选自：B2
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微球蛋白、α1
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微球蛋白、α2
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微球蛋白和α3
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微球蛋白；
[0031](iii)MHC II类分子，其选自：HLA
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DP、HLA
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DM、HLA
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DOA、HLA
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DOB、HLA
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DQ和HLA
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DR；
[0032](iv)下调免疫应答的受体，其选自：程序性细胞死亡蛋白1(PD
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1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA
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4)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域3(Tim3)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、CD94、NKG2A、TIGIT、BTLA、Fas、TBR2、LAG3和蛋白酪氨酸磷酸酶；
[0033](v)在T细胞上表达的配体，其选自：CD5、CD7和CD2。
[0034](vi)调节免疫应答的胞质蛋白，其选自：Csk、SHP1、SHP2、Zap
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70、SLP76和AKT。
[0035]该细胞还可以包含嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)。
[0036]在第二方面，本专利技术提供了核酸构建体，其包含：
[0037](i)第一核酸序列，其编码包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域的靶标结合多肽；和
[0038](ii)第二核酸序列，其编码包含与第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用
结构域以及细胞内保留信本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.工程化免疫细胞，其包含：(i)靶标结合多肽，其包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和(ii)定位多肽，其包含与所述第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。2.根据权利要求1的工程化免疫细胞，其包含：(i)至少两个靶标结合多肽，其中每个靶标结合多肽包含靶标结合结构域和第一蛋白相互作用结构域；和(ii)定位多肽，其包含与每个靶标结合多肽的第一蛋白结合结构域结合的第二蛋白相互作用结构域以及细胞内保留信号。3.根据权利要求1或2的工程化免疫细胞，其中所述细胞内保留信号选自下组：高尔基体保留序列；跨高尔基体网络(TGN)回收信号；内质网(ER)保留序列；蛋白酶体定位序列和溶酶体分选信号。4.根据前述权利要求中任一项的工程化免疫细胞，其中所述细胞内保留信号选自：a)包含选自以下的氨基酸序列的高尔基体保留序列：SEKDEL(SEQ ID NO:1)、KDEL(SEQ ID NO:2)、KKXX(SEQ ID NO:3)、KXKXX(SEQ ID NO:4)，包含序列KYKSRRSFIDEKKMP(SEQ ID NO:5)的腺病毒E19蛋白尾部，包含序列MHRRRSRSCR(SEQ ID NO:6)、KXD/E(SEQ ID NO:7)或YQRL(SEQ ID NO:8)的HLA恒定链片段，其中X为任何氨基酸；和/或b)选自以下的内质网保留结构域：核糖体结合糖蛋白I、核糖体结合糖蛋白II、SEC61或细胞色素b5；和c)包含表1至5中所示的任何序列的细胞内保留信号。5.根据前述权利要求中任一项的工程化免疫细胞，其中所述靶标结合结构域或每个靶标结合结构域包含单结构域抗体(dAb)。6.根据前述权利要求中任一项的工程化免疫细胞，其中所述靶标结合结构域或每个靶标结合结构域与CD3/T细胞受体(TCR)复合物的组分、细胞因子、人白细胞抗原(HLA)I类分子、MHC II类分子、下调免疫应答的受体、在T细胞上表达的配体、或调节免疫应答的胞质蛋白结合。7.根据权利要求6的工程化免疫细胞，其中所述靶标结合结构域或每个靶标结合结构域与选自下组的靶标结合：(i)CD3/TCR复合物的组分，其选自：CD3ε、TCRα、TCRαβ、TCRγ、TCRδ、CD3δ、CD3γ和CD3ζ；(ii)HLAI类分子，其选自：B2
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微球蛋白、α1
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微球蛋白、α2
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微球蛋白和α3
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微球蛋白；(iii)MHC II类分子，其选自：HLA
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DP、HLA
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DM、HLA
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DOA、HLA
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DOB、HLA
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DQ和HLA
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DR；(iv)下调免疫应答的受体，其选自：程序性细胞死亡蛋白1(PD
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1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA
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4)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域3(Tim3)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)、CD94、NKG2A、TIGIT、BTLA、Fas、TBR2、LAG3和蛋白酪氨酸磷酸酶；(v)在T细胞上表达的配体，其选自：CD5、CD7和CD2；(vi)调节免疫应答的胞质蛋白，其选自：Csk、SHP1、SHP2、Zap
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70、SLP76和AKT。8.根据前述权利要求中任一项的工程化免疫细胞，其中所述细胞还包含嵌合抗原受体(...

【专利技术属性】
技术研发人员：M普勒，S科多巴，S奥诺哈，S托马斯，T格罗希尔，
申请(专利权)人：奥托路斯有限公司，
类型：发明
国别省市：