方法技术

本发明专利技术提供了治疗实体癌的方法，其包括向受试者施用细胞的步骤，其中所述细胞包含位于框架滑动基序(FSM)或翻译通读基序(TRM)下游的编码白细胞介素12(IL

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】方法
专利

[0001]本专利技术涉及表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，诸如CAR
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T细胞，该细胞分泌白细胞介素
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12(IL
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12)。编码IL
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12的序列位于框架滑动基序(FSM)或翻译通读基序(TRM)的下游使得IL
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12以非常低的水平分泌。
[0002]专利技术背景
[0003]肿瘤异质性描述了不同的肿瘤细胞可以显示出有区别的形态学和表型概况的观察现象，包括细胞形态、基因表达、代谢、运动性、增殖和转移潜力。
[0004]异质性在患者之间、肿瘤之间(肿瘤间异质性)和肿瘤内部(肿瘤内异质性)发生。已经在肿瘤细胞之间观察到多种类型的异质性，源于遗传和非遗传变异性。
[0005]由于肿瘤微环境中的异质性，肿瘤细胞之间的异质性可以进一步增加。肿瘤中的区域差异(例如氧气的可用性)对肿瘤细胞施加不同的选择压力，导致在肿瘤的不同空间区域中较宽的优势亚克隆谱。微环境对克隆优势的影响也是在许多患者中看到的原发性和转移性肿瘤之间的异质性以及在具有相同肿瘤类型的患者之间观察到的肿瘤间异质性的可能原因。
[0006]癌细胞的异质性为设计有效的治疗策略引入了重大的挑战。
[0007]例如，异质性肿瘤可以在不同的克隆群中展现出对细胞毒性药物不同的敏感性。这归因于可抑制或改变治疗功效的克隆相互作用。
[0008]在异质性肿瘤中的药物施用很少会杀伤全部肿瘤细胞。最初的异质性肿瘤群可能成为瓶颈，使得很少的药物抗性细胞(如果有的话)会存活。这容许抗性肿瘤群通过分支进化机制复制并生长新的肿瘤。产生的重新增殖的肿瘤是异质性的，并且对所使用的最初药物治疗具有抗性。重新增殖的肿瘤也可能以更有侵略性的方式返回。
[0009]因此，需要可替代的方法以解决实体瘤中抗原异质性的问题。
[0010]嵌合抗原受体(CAR)
[0011]已经描述了许多用于癌症治疗的免疫治疗剂，包括治疗性单克隆抗体(mAb)、双特异性T细胞衔接器和嵌合抗原受体(CAR)。
[0012]嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应子功能的蛋白质。它们的通常形式是I型跨膜域蛋白的形式，其具有抗原识别氨基末端、间隔物、跨膜域，上述结构全部与传递T细胞存活和激活信号的复合胞内域相连。
[0013]这些分子最常见的形式是衍生自识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)经由间隔物和跨膜域融合至信号传导胞内域的融合物。此类分子引起T细胞响应scFv对其靶标的识别而激活。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀伤表达靶抗原的靶细胞。已经开发了几种针对肿瘤相关抗原的CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前正在临床试验中，用于治疗多种癌症。
[0014]迄今为止，CAR T细胞的成功主要在于血液恶性肿瘤。靶向B细胞抗原CD19的CAR首次成功用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。2017年8月，FDA批准了使用CART19(Kymriah)治疗小儿复发性或难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)，并且在同年10月，FDA批准了另一个
靶向CD19的CAR(Yescarta)用于成人复发性或难治性大B细胞淋巴瘤。此外，2018年6月欧洲药品管理局(EMA)也批准了这两种药物的使用。然而，尽管进行了大量的研究，实体瘤的CAR T细胞疗法还远没有那么成功。
[0015]克服不利的肿瘤微环境
[0016]对于成功的基于细胞的实体癌的免疫治疗性治疗需要克服的关键障碍之一是肿瘤微环境(TME)，其已经被广泛表征为对T细胞不利。对于CAR
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T细胞也是如此，对于其他免疫治疗方法诸如使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和表达工程化的T细胞受体(TCR)的T细胞也是如此。
[0017]肿瘤细胞的糖酵解代谢使环境缺氧、酸性、营养成分低并倾向于氧化应激。在炎症环境中，肿瘤细胞通常上调结合T细胞上抑制性受体的配体，诸如程序性细胞死亡配体1(PD
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1)和半乳糖凝集素
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9。肿瘤微环境还依赖于基质细胞，如癌症相关成纤维细胞(CAF)和抑制性免疫细胞，包括髓系来源的抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、肥大细胞和调节性T细胞(Treg)。这些细胞和肿瘤细胞分泌可溶性因子，如血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子β(TGFβ)，这些可溶性因子有助于使肿瘤血管系统异常、促进TAM和其他免疫细胞的抗炎极化并参与EMT。它们还产生活性氧种类(ROS)和分子，如乳酸、吲哚胺2,3
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双加氧酶(IDO)、前列腺素E2(PGE2)、可溶性Fas和腺苷，这些分子有助于T细胞免疫应答的抑制。
[0018]已经在临床前和临床试验中均测试了施用细胞因子使肿瘤环境极化以对T细胞更友好并改善CAR T细胞招募和功能。已经显示诱导炎症性免疫细胞招募的局部IL
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12递送增强了在小鼠中过继转移的抗VEGFR
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2CAR T细胞的抗肿瘤活性。已经创造了组成型分泌细胞因子诸如IL
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12的CAR T细胞(称为“装甲的”CAR)，以增强T细胞在实体瘤中的浸润和功能。然而，这些方法具有局限性：细胞因子的全身性施用可能是有毒性的；细胞因子的组成型产生可能导致不受控制的增殖和转化(Nagarkatti et al(1994)PNAS91:7638
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7642；Hassuneh et al(1997)Blood 89:610
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620)。
[0019]因此，需要可替代的方法来帮助免疫治疗细胞(诸如CAR
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T细胞)在实体瘤的不利的微环境中存活并持续存在。
附图说明
[0020]图1—显示经典的嵌合抗原受体的示意图。
[0021](a)嵌合抗原受体的基本架构；(b)第一代受体；(c)第二代受体；(d)第三代受体。
[0022]图2—框架滑动基序和构建体设计。
[0023](A)示出了框架滑动基序的图形，其中一连串七个尿嘧啶插入到转基因序列中，其促进框架滑动。框架滑动导致替代性地阅读框继续转录/翻译，通常在
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1方向，并且产生功能性蛋白质。(B)构建体的结构，显示了转基因、框架滑动基序(SLIP)和2A自切割肽序列的位置。(C)流式细胞术分析转导了构建体的SupT1细胞，该构建体含有RQR8分拣选择标记，之后为对照序列(6xU)或框架滑动基序(7xU)之一和CD22
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CD19嵌合蛋白，该嵌合蛋白由融合至CD19的跨膜和截短的胞内域的CD22的胞外域组成。框架滑动基序的引入导致CD22
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CD19嵌合物的表达显著降低，而观察到RQR8分拣选择标记相似的水平。
[0024]图3—翻译通读基序和构建体设计。
[0025](A)已知的翻译通读基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.治疗实体癌的方法，其包括向受试者施用细胞的步骤，其中所述细胞包含位于框架滑动基序(FSM)或翻译通读基序(TRM)下游的编码白细胞介素12(IL
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12)的核酸序列。2.根据权利要求1的方法，其包括以下步骤：(i)从受试者中分离细胞样品；(ii)用位于框架滑动基序(FSM)或翻译通读基序(TRM)下游的编码白细胞介素12(IL
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12)的核酸序列转染或转导来自所述细胞样品的细胞；和(iii)向所述受试者施用来自步骤(ii)的转导的或转染的细胞。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述编码IL
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12的核酸序列编码“flexi
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IL
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12”：通过接头连接的IL
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12α和IL
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12β亚基之间的融合物。4.根据权利要求3的方法，其中flexi
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IL
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12包含如SEQ ID No.1所示的序列。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码白细胞介素(IL
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12)的核酸序列位于框架滑动基序(FSM)的下游，并且所述FSM包含尿嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤碱基的重复。6.根据权利要求5的方法，其中所述FSM包含序列UUUUUUU(SEQ ID No.2)。7.根据权利要求5或6的方法，其中所述FSM还包含终止密码子。8.根据权利要求7的方法，其中所述FSM包含以下序列之一：UUUUUUUGA(SEQ ID NO.3)UUUUUUUAG(SEQ ID NO.4)UUUUUUUAA(SEQ ID NO.5)。9.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述编码白细胞介素(IL
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12)的核酸序列位于翻译通读基序(TRM)的下游，所述TRM包含序列STOP
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CUAG或STOP
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CAAUUA，其中“STOP”是终止密码子。10.根据权利要求9的方法，其中所述翻译通读基序包含以下序列之一：UGA
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CUAG(SEQ ID No.6)UAG
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CUAG(SEQ ID No.7)UAA
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CUAG(SEQ ID No.8)UGA
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CAAUUA(SEQ ID No.9)UAG
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CAAUUA(SEQ ID No.10)UAA
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CAAUUA(SEQ ID No.11)。11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是肿瘤浸润免疫细胞。12.根据权利要求11的方法，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、单核细胞、巨噬细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或工程化的T细胞受体(TCR)。14.根据权利要求12或13的方法，其中所述CAR或工程化的TCR结合以下靶抗原之一：双唾液酸神经节苷脂(GD2)、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、人表皮生长因子受体(HER2)、L1CAM、粘蛋白1(MUC1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)。15.根据权利要求14的方法，其中所述细胞表达结合GD2并具有抗原结合域的CAR，所述抗原结合域包含
a)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含具有以下序列的互补决定区(CDR)：CDR1
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SYNIH(SEQ ID No.12)；CDR2
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VIWAGGSTNYNSALMS(SEQ ID No.13)；CDR3
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RSDDYSWFAY(SEQ ID No.14)；和b)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含具有以下序列的CDR：CDR1
–
RASSSVSSSYLH(SEQ ID No.15)；CDR2
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STSNLAS(SEQ ID No.16)；CDR3
–
QQYSGYPIT(SEQ ID No.17)。16.根据权利要求14的方法，其中所述细胞表达结合PSMA并具有抗原结合域的CAR，所述抗原结合域包含a)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含具有以下序列的互补决定区(CDR)：CDR1
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SSWMN(SEQ ID No.18)；CDR2
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RIYPGDGDTNYAQK...

【专利技术属性】
技术研发人员：M德拉佩鲁塔，M里吉，G阿格利亚迪，M普勒，S科多巴，J锡利伯恩，
申请(专利权)人：奥托路斯有限公司，
类型：发明
国别省市：