嵌合蛋白制造技术

本发明专利技术提供具有以下式的嵌合蛋白：Casp

【技术实现步骤摘要】
嵌合蛋白
[0001]本申请是基于申请日为2016年2月23日，优先权日为2015年2月24日，申请号为201680006920.1，专利技术名称为“嵌合蛋白”的专利申请的分案申请。
专利

[0002]本专利技术涉及在过继性细胞疗法(ACT)中有用的嵌合蛋白。所述嵌合蛋白可以起自杀基因作用，使得表达所述嵌合蛋白的细胞能够被删除。本专利技术还提供编码此类嵌合蛋白的核酸，包含此类核酸的细胞及其治疗用途。
[0003]专利技术背景
[0004]过继性细胞疗法
[0005]过继免疫疗法是已经建立且不断发展的治疗方法。在同种异体造血干细胞移植(HSCT)的背景中，经常给予供体淋巴细胞输注(DLI)以治疗血液恶性肿瘤的复发。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)在治疗转移性黑色素瘤中是有效的。对T细胞的遗传工程化大大增加了T细胞疗法的范围和效力：T细胞受体转移允许靶向细胞内癌症抗原，而嵌合抗原受体(CAR)允许靶向表面癌症或谱系特异性抗原。已经使用两种方法观察了临床反应，并且正在进行许多进一步的试验。
[0006]过继性免疫疗法后可发生急性不良事件。移植物抗宿主病(GVHD)是DLI的常见且严重的并发症。工程化T细胞的施用也导致毒性。例如，在针对黑色素瘤抗原的天然T细胞受体转移研究中已经报道了中靶脱肿瘤毒性(on
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target off
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tumour toxicity)；再定向(re
‑
directed)至肾细胞癌抗原碳酸酐酶IX(CAIX)的T细胞产生出乎意料的肝毒性。CD19 CAR疗法后报道了免疫激活综合征。最后，载体诱导的插入诱变导致淋巴增殖性病症的理论风险。这些毒性的发生率和严重性是不可预知的。此外，与其不良事件通常以治疗剂的半衰期减退的治疗性蛋白或小分子相反，T细胞植入并且复制，这潜在地导致升高且暴发性毒性。
[0007]自杀基因
[0008]自杀基因是遗传编码的机制，其允许在面对不可接受的毒性时选择性地破坏过继性转移的细胞，例如T细胞。已经在临床研究中测试了两种自杀基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV
‑
TK)和诱导型胱天蛋白酶9(iCasp9)。
[0009]单纯疱疹病毒I来源的胸苷激酶(HSV
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TK)基因已经用作供体T细胞输注的体内自杀开关，用于治疗造血干细胞移植后的复发性恶性肿瘤和埃巴病毒(EBV)淋巴增殖。然而，对引起移植物抗宿主病的T细胞的破坏是不完全的，并且使用更昔洛韦(或类似物)作为前药来激活HSV
‑
TK，排除了更昔洛韦作为巨细胞病毒感染的抗病毒药物的施用。此外，即使在免疫抑制的人类免疫缺陷病毒和骨髓移植患者中，HSV
‑
TK导向的免疫应答也导致HSV
‑
TK转导的细胞的消除，损害了输注的T细胞的持续性并因此降低其功效。
[0010]在原始iCasp9分子中利用了胱天蛋白酶9背后的活化机制。胱天蛋白酶被活化所需要的所有，是克服胱天蛋白酶同二聚化的能量障碍。同二聚体经历构象变化，且二聚体对之一的蛋白水解结构域变得有活性。在生理上，这通过胱天蛋白酶9的CARD结构域结合到
APAF
‑
1而发生。在iCasp9中，APAF
‑
1结构域被修饰的FKBP12替代，所述修饰的FKBP12已经突变以选择性地结合二聚化化学诱导剂(CID)。CID的存在导致同二聚化和活化。iCasp9基于与人FK506结合蛋白(FKBP)融合的经修饰的人胱天蛋白酶9(Straathof et al.,(2005)Blood 105：4247
‑
4254)。其使得能够在称为AP1903的小分子CID的存在下进行条件性二聚化。AP1903是一种实验性药物，并认为是生物惰性的，因为它不与野生型FKBP12相互作用。然而，使用该试剂的临床经验限于非常少数的患者(Di Stasi,A.et al.(2011)N.Engl.J.Med.365,1673
–
1683；and Iuliucci,J.D.et al.(2001)J.Clin.Pharmacol.41,870
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879)。AP1903也是一种相对较大的极性分子，且不太可能穿过血脑屏障。
[0011]在一种替代方法中，使用复杂策略可以通过小分子活化执行剂(executioner)胱天蛋白酶，该策略涉及将烟草蚀刻病毒(TeV)蛋白水解位点导入胱天蛋白酶3或6或7和与分开的TEV蛋白酶(其在雷帕霉素的存在下重组)共表达(Morgan et al(2014)Methods Enzymol.544:179
‑
213)。这由于一些原因对于临床上有用的自杀开关来说是不满意的策略：首先需要三种分开的蛋白质，这是高度复杂的：分别是修饰的胱天蛋白酶和拆分的TeV蛋白酶的两个组分；其次，TeV组分是异种的(xenogeneic)，可能具有免疫原性；最后，该策略仅活化蛋白酶敏感的胱天蛋白酶分子，其是顶端(apical)胱天蛋白酶下游的且相比顶端(apical)胱天蛋白酶较不敏感。
[0012]已经描述了基于FAS的CID活化的自杀基因(Amara et al(1999)Hum.Gene Ther.10,2651
–
2655)。这也取决于该CID用于激活，并且由于它不直接活化细胞凋亡级联，因此逃避(通过FAS抗性)是可能的。
[0013]基于替换实验性CID需求的标准药物的同二聚化体系将是有吸引力的替代方案。然而，没有同二聚化小分子药物可用。
[0014]已经提出了其它自杀基因，例如全长CD20，当在T细胞上表达时可以使T细胞对通过治疗性抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)的裂解易感(Introna,M.et al.(2000)Hum.Gene Ther.11,611
–
620)。关于抗体识别这一主题还描述了其它自杀基因，例如：RQR8使T细胞对CD20易感，但比全长CD20分子更紧凑(Philip,B.et al.(2014)Blood doi:10.1182/blood
‑
2014
‑
01
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545020)；EGFR的截短形式(huEGFRt)使得细胞对通过抗EGFR mAb的裂解易感(Wang,X.et al.(2011)Blood 118,1255
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1263)；以及在细胞表面上表达的myc表位标签使得细胞对使用抗myc抗体的裂解易感(Kieback et al(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,623
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628)。这些抗体依赖性方法的主要限制是它们依赖于起作用的高局部浓度的治疗性抗体的生物可用度。已知例如裂解性抗体对于大块疾病(bulky disease)并不特别有效，并且基于抗体的自杀基因的限制是在没有达到高抗体浓度的细胞驻留者(resident)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有以下式的嵌合蛋白：Ht1
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Ht2
‑
Casp其中Casp是胱天蛋白酶结构域；Ht1是第一异二聚化结构域；和Ht2是第二异二聚化结构域且其中，在二聚化化学诱导剂(CID)的存在下，相同的一对所述嵌合蛋白相互作用，使得来自一个嵌合蛋白的Ht1与来自另一个嵌合蛋白的Ht2异二聚化，导致两个胱天蛋白酶结构域的同二聚化。2.根据权利要求1的嵌合蛋白，其中Ht1不与相同嵌合蛋白内的Ht2异二聚化。3.根据权利要求1或2的嵌合蛋白，其中所述胱天蛋白酶结构域包含选自下组的引发剂(initiator)胱天蛋白酶：胱天蛋白酶
‑
8、胱天蛋白酶
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9和胱天蛋白酶
‑
10。4.根据权利要求1或2的嵌合蛋白，其中所述胱天蛋白酶结构域包含选自胱天蛋白酶
‑
3和胱天蛋白酶
‑
7的执行剂(executioner)胱天蛋白酶。5.根据前述权利要求中任一项的嵌合蛋白，其中一个异二聚化结构域包含FK
‑
506结合蛋白(FKBP)，而另一个异二聚化结构域包含mTOR的FRB结构域。6.根据权利要求5的嵌合蛋白，其中Ht1包含FRB，且Ht2包含FKBP。7.根据权利要求5或6的嵌合蛋白，其中所述CID是雷帕霉素或雷帕霉素类似物。8.嵌合蛋白，其包含胱天蛋白酶结构域和异二聚化结构域，所述异二聚化结构域包含mTOR的FRB结构域。9.核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的嵌合蛋白。10.核酸构建体，其包含一个或多个根据权利要求9的核酸序列和编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。11.核酸构建体，其包含编码包含胱天蛋白酶结构域和异二聚化结构域的嵌合蛋白的核酸序列和编码根据权利要求8的嵌合蛋白的核酸序列，所述异二聚化结构域包含FK506结合蛋白(FKBP)。12.核酸构建体，其具有以下结构：Ht1
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Casp
‑
coexpr
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Ht2
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Ht2其中Casp是编码胱天蛋白酶结构域的核酸序列；Ht1是编码第一异二聚化结构域的核酸序列；Ht2是编码第二异二聚化结构域的核酸序列；和coexpr是允许Ht1
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Casp和Ht2
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Ht2共表达的核酸序列，其中所述核酸构建体的表达导致嵌合蛋白Ht1
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Casp和界面(interfacing)蛋白Ht2
‑
Ht2的产生，且其中在二聚化化学诱导剂(CID)的存在下，一对所述嵌合蛋白Ht1
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Casp9相互作用，使得来自每个嵌合蛋白的Ht1与来自界面蛋白的Ht2结构域异二聚化，导致两个胱天蛋白酶结构域的同二聚化。13.根据权利要求12的核酸构建体，其中Ht1包含FK
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506结合蛋白(FKBP)，且Ht2包含mTOR的FRB结构域。
14.根据权利要求11至13中任一项的核酸构建体，其还包含编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。15.载体，其包含根...

【专利技术属性】
技术研发人员：M普勒，R特洛布里治，E霍奇金，
申请(专利权)人：奥托路斯有限公司，
类型：发明
国别省市：