一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及肿瘤生物免疫治疗技术领域，具体公开了一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。本发明专利技术构建了靶向人Siglec6的嵌合抗原受体(CAR)以及该CAR的重组表达载体和该CAR修饰的免疫应答细胞。该CAR结构通过抗原特异性识别Siglec6后，可以激活该免疫应答细胞，启动其细胞毒性杀伤作用，靶向杀伤AML肿瘤细胞及白血病干细胞。经体内外实验证明，该CAR

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤生物免疫治疗
，尤其是涉及一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR
‑
T)疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人工表达能识别特定肿瘤表面抗原的抗原结合域，使T细胞获得抗体的特异性肿瘤识别能力，并识别肿瘤细胞之后通过CAR的胞内信号区激活T细胞，从使CAR
‑
T细胞通过释放细胞因子、颗粒酶等方式发挥细胞毒作用，从而靶向清除恶性肿瘤细胞的一种新型免疫疗法。多项临床研究已经证实，这种工程化T细胞能够对多种难治性血液肿瘤显示出高效的抗肿瘤活性。然而，CAR
‑
T细胞也会因脱靶效应等，导致一些临床副作用和毒性。
[0003]目前，CAR
‑
T在B细胞恶性血液肿瘤和多发性骨髓瘤中已经展现出了很好的疗效，已有六款以CD19和BCMA为靶抗原的CAR
‑
T细胞产品经美国FDA批准上市。然而在髓系恶性血液肿瘤和实体瘤中，CAR
‑
T细胞仍然作用有限，其临床应用也鲜有进展。有研究已研制出多种靶向AML不同靶点的CAR
‑
T细胞，主要的靶点有CLL
‑
1，CD33，CD123等。虽然上述几种靶向AML肿瘤表面抗原的CART已投入临床试验，但是效果均较不佳。根据现有研究表明，靶向CLL
‑
1的CAR
‑
T细胞在临床试验中的疗效佳，但由于CLL
‑
1在正常粒细胞中也表达，因此会引起严重的粒细胞缺乏症从而影响治疗后患者的正常造血功能恢复，使用CLL1 CART治疗的患者往往需要桥接造血干细胞移植，这很大程度上限制了此CART的临床应用；而靶向CD123的CAR
‑
T细胞治疗的临床数据显示CR率很低，效果不佳，而此外的靶向其他靶点的CAR
‑
T细胞也均未达到理想的疗效。限制CAR
‑
T细胞对AML疗效的很重要的一个原因在于缺乏稳定表达于髓系恶性肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞之上的特异性靶抗原，靶点的特异性越强，越有助于CAR
‑
T细胞识别和杀伤肿瘤细胞，也有利于减轻CAR
‑
T细胞的脱靶毒性。
[0004]因此，亟需新的针对AML的CART治疗靶点并设计和构建CART细胞。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其构建方法和应用。本专利技术构建出嵌合抗原受体，结合目前CAR
‑
T工程技术，制备出能够特异性识别和杀伤髓系肿瘤等恶性肿瘤的免疫应答细胞(例如T细胞)，有希望为今后靶向Siglec6的其他免疫效应细胞疗法的设计提供依据，有希望为急性髓系白血病的治疗提供一种新的方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]第一目的，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含：
[0008]从羧基端到氨基端依次为标签蛋白、切割蛋白、信号肽结构域、抗原结合结构域，
跨膜结构域，共刺激信号结构域，胞内信号传导结构域；所述抗原为Siglec6。
[0009]本专利技术的嵌合抗原受体上融合标签蛋白，用于标记、分选、消除宿主细胞。跨膜结构域用于锚定结合细胞膜，在抗原识别之后，激活信号被跨膜结构域传递到细胞内部。
[0010]本专利技术构建的嵌合抗原受体靶向的Siglec6抗原在原代AML母细胞及AML干细胞亚群中表达，而在正常的中性粒细胞及造血干细胞等细胞亚群中不表达，因此能在赋予免疫应答细胞(例如T细胞)特异性识别AML肿瘤细胞及更强抗肿瘤能力的同时也不会造成粒细胞缺乏等脱靶毒性。
[0011]作为本专利技术所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述标签蛋白包括RQR8、EGFRt、CD20、c
‑
MYC、6
×
His、GST、Fc、Flag、HA中的至少一种；所述切割蛋白包括切割蛋白2A或弗林蛋白酶；所述切割蛋白2A包括切割蛋白T2A、切割蛋白P2A、切割蛋白E2A、切割蛋白F2A中的至少一种。
[0012]所述标签蛋白可以通过可切割蛋白(可以为2A或弗林蛋白酶)或启动子与CAR连接存在于CAR构建体上。
[0013]作为本专利技术所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述标签蛋白为RQR8，所述切割蛋白为切割蛋白T2A；所述RQR8的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述切割蛋白T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0014]该嵌合抗原受体的结构带有RQR8自杀开关，当CAR
‑
T细胞在治疗过程中毒性过强时，可利用CD20单抗启动抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用和补体依赖的细胞毒性(CDC)作用以诱导CART自杀，从而使其更加安全可控，具有较高临床应用价值。
[0015]作为本专利技术所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述信号肽结构域包括人CD8α信号肽结构域、人GM
‑
CSF信号肽结构域、人胰岛素信号肽结构域、人IL
‑
2信号肽结构域、人胰蛋白酶原信号肽结构域中的至少一种，优选地，所述信号肽结构域为人CD8α信号肽结构域，所述人CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0016]作为本专利技术所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗原结合结构域为抗Siglec6的单链抗体核酸序列。
[0017]作为本专利技术所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区通过至少一个linker连接。其排列方式可为VH—linker—VL或VL—linker—VH。
[0018]在一些实施例中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)来源于全人源抗体JML1。
[0019]在一些实施例中，linker的长度可以为1～25个或多个氨基酸。
[0020]作为本专利技术所述嵌合抗原受体的优选实施方式，所述linker包括甘氨酸聚合物(G)
n
、甘氨酸
‑
丝氨酸聚合物(G1
‑
5S1
‑
5)
n
、甘氨酸
‑
丙氨酸聚合物、丙氨酸
‑
丝氨酸聚合物、LRQKD(GGGS)2ERP、DGGGS、LRQRDGERP、TGEKP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKVD、GGRRGGGS、GGRR、LRQKDGGGSERP和(GGGGS)
n
中的至少一种；甘氨酸聚合物(G)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含：从羧基端到氨基端依次为标签蛋白、切割蛋白、信号肽结构域、抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激信号结构域，胞内信号传导结构域；所述抗原为Siglec6。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述标签蛋白包括RQR8、EGFRt、CD20、c
‑
MYC、6
×
His、GST、Fc、Flag、HA中的至少一种；所述切割蛋白包括切割蛋白2A或弗林蛋白酶；所述切割蛋白2A包括切割蛋白T2A、切割蛋白P2A、切割蛋白E2A、切割蛋白F2A中的至少一种；优选地，所述标签蛋白为RQR8，所述切割蛋白为切割蛋白T2A；所述RQR8的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述切割蛋白T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽结构域包括人CD8α信号肽结构域、人GM
‑
CSF信号肽结构域、人胰岛素信号肽结构域、人IL
‑
2信号肽结构域、人胰蛋白酶原信号肽结构域中的至少一种，优选地，所述信号肽结构域为人CD8α信号肽结构域，所述人CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域为抗Siglec6的单链抗体核酸序列。5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区通过至少一个linker连接。6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述linker包括甘氨酸聚合物(G)
n
、甘氨酸
‑
丝氨酸聚合物(G1
‑
5S1
‑
5)
n
、甘氨酸
‑
丙氨酸聚合物、丙氨酸
‑
丝氨酸聚合物、LRQKD(GGGS)2ERP、DGGGS、LRQRDGERP、TGEKP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKVD、GGRRGGGS、GGRR、LRQKDGGGSERP和(GGGGS)
n
中的至少一种；其中，甘氨酸
‑
丝氨酸聚合物(G1
‑
5S1
‑
5)
n
中的n为大于1的整数；(GGGGS)
n
中的n为1、2、3、4或5。7.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Siglec6的单链抗体核酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兵，赵明峰，郭睿婷，
申请(专利权)人：天津市第一中心医院，
类型：发明
国别省市：