一种重组纤维连接蛋白功能性短体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组纤维连接蛋白功能性短体及其制备方法。重组纤维连接蛋白功能性短体包括细胞结合肽、纤维连接蛋白胶原蛋白结合蛋白结合域序列和金环蛇毒抗菌肽顺序连接的融合多肽；所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述细胞结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述金环蛇毒抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明专利技术重组纤维连接蛋白功能性短体及其制备方法，能有效解决纤维连接蛋白分子量小，半衰期短，使用时容易红肿感染的缺点，有利于在促细胞吸附和生长、伤口愈合和抗菌方面的应用。抗菌方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组纤维连接蛋白功能性短体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及了一种重组纤维连接蛋白功能性短体及其制备方法。

技术介绍

[0002]纤维连接蛋白是一种大的纤维状糖蛋白，由两个亚基通过C末端的二硫键交联形成，每个亚基的分子量为220～250kDa，整个分子呈V型，广泛分布于机体组织中。传统的纤维连接蛋白提取自动物血浆，具有一定的风险性，且其分子量较大，难以渗透进入皮肤被吸收利用。如中国专利技术专利CN102675473A公开了一种基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500
‑
1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接；目前重组的纤维连接蛋白主要取其功能结构区一部分，分子量大大减少，一般为60～70kD，但仍存在渗透力差，作用单一的缺点。特别是应用到美容领域时，为增加蛋白液渗透率，通常采用进一步减小重组纤维蛋白分子量或微针微创的方法。但是采用更小分子量的短肽，一方面其表达后易降解，半衰期短，另一方面纯化工艺困难。而采用微针微创的方法常常会引起细菌感染，造成皮肤的红肿甚至溃烂。而在应用到损伤治疗领域时，也需要格外注意感染情况的发生。

技术实现思路

[0003]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种重组纤维连接蛋白功能性短体及其应用，能有效解决皮肤渗透能力及吸附能力差、作用时间短、易感染的技术问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种重组纤维连接蛋白功能性短体，具体为细胞结合肽、连接肽、纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列、连接肽和金环蛇毒抗菌肽几种活性多肽顺序连接的融合多肽；
[0005]所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
[0006]所述细胞结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
[0007]所述纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
[0008]所述金环蛇毒抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0009]金环蛇是一种广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南地区的具有前沟牙的毒蛇。其体内的抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌及病毒均具有非常强的杀伤活性，对一些耐药性细菌同样具有作用。
[0010]进一步地，在本专利技术中，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSNNKGGGGS或GGGGSNNKNNKGGGGS或GGGGSNNKNNKNNKGGGGS中的一种。
[0011]本专利技术第二方面，提供了一种编码上述重组纤维连接蛋白功能性短体蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]本专利技术第三方面，提供了一种重组表达载体pGAPZa
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A FN，所述表达载体包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0013]本专利技术第四方面，提供了一种酵母工程菌，含有所述的重组表达载体。
[0014]本专利技术第五方面，一种重组纤维连接蛋白功能性短体的制备方法，包括如下步骤：
[0015](1)在如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列5
’
和3
’
两端加入限制性内切酶核苷酸序列；
[0016](2)将步骤(1)序列插入到表达载体pGAPZa
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A上，并线性化，转入毕赤酵母感受态细胞中，筛选高表达重组纤维连接蛋白功能性短体的单克隆菌株；
[0017](3)将步骤(2)筛选的菌株进行表达纯化，获得重组纤维连接蛋白功能性短体。
[0018]本专利技术第六方面，本专利技术所述重组纤维连接蛋白功能性短体在细胞接触吸附和伸展延伸方面的应用，具体如在细胞培养中的应用。
[0019]本专利技术第七方面，本专利技术所述重组纤维连接蛋白功能性短体在伤口愈合方面的应用，具体如在组织缝合中的应用。
[0020]本专利技术第八方面，本专利技术所述重组纤维连接蛋白功能性短体在抗菌方面的应用，具体如在制备抗菌材料中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]1、本专利技术的细胞结合肽与纤维连接蛋白结合胶原蛋白结合域序列、蛇毒抗菌肽，通过富含天冬酰胺和赖氨酸的柔性连接肽相连接，得到增强了与细胞、胶原蛋白结合的能力，并同时具备抗菌活性，可有效解决微创易感染的问题。
[0023]2、本专利技术的重组纤维连接蛋白功能性短体分子量更小，约42kD，皮肤渗透率较传统的重组纤维连接蛋白(60～70kD)更佳。且通过融合细胞结合肽和柔性连接肽解决了单一纤维连接蛋白功能结构域半衰期短(3min)的缺点，蛋白更稳定，有效作用时间长(半衰期延长至大于20h)。
[0024]3、本专利技术构建的重组纤维连接蛋白功能性短体应用广泛，能够应用于化妆品添加剂，临床上皮肤损伤修复等方面。
附图说明
[0025]图1为商用载体pGAPZa
‑
A；
[0026]图2为本专利技术高拷贝毕赤酵母菌株的筛选平板，其中1～23为高浓度抗生素筛选出的单克隆划线培养；
[0027]图3为本专利技术高表达菌株的电泳结果图，其中泳道1为毕赤酵母空宿主上清液sds
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page电泳图，图2至6分别对应图2中4/9/11/13/14号克隆子发酵上清sds
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page电泳图；
[0028]图4为本专利技术图3高表达菌株的蛋白免疫印迹结果图，其中1为毕赤酵母空宿主上清组，图2至6分别对应图2中4/9/11/13/14号克隆子发酵上清组；
[0029]图5为本专利技术为重组纤维连接蛋白的纯化图谱，其中泳道1～3分别为弱阳离子交换柱层析纯化，疏水层析纯化，分子筛层析纯化收集液sds
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page电泳图；
[0030]图6为本专利技术不同浓度重组纤维连接蛋白促细胞吸附曲线图；
[0031]图7为本专利技术不同浓度重组纤维连接蛋白促细胞增殖曲线图；
[0032]图8为本专利技术不同浓度重组纤维连接蛋白对痤疮杆菌的抑制作用图，其中1～6分别是不同浓度的重组纤维连接蛋白功能性短肽对痤疮杆菌的抑制效果；
[0033]图9为未融合金环蛇抗菌肽的细胞结合肽、连接肽、纤维连接蛋白结合胶原蛋白结构域序列顺序连接融合蛋白纯化后sds
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page电泳图；
[0034]图10为不同浓度重组纤维连接蛋白及细胞结合肽、连接肽、纤维连接蛋白结合胶原蛋白结构域序列顺序连接融合蛋白不同促细胞增殖曲线图。
具体实施方式
[0035]如
技术介绍
描述的，目前重组的纤维连接蛋白主要取其功能结构区一部分，分子量大大减少，一般为60～70kD，但仍存在渗透力差，作用单一的缺点。特别是应用到美容领域时，为增加蛋白液渗透率，通常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组纤维连接蛋白功能性短体，其特征在于，其为细胞结合肽、纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列、蛇毒抗菌肽顺序连接的融合肽；所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述细胞结合肽如SEQ ID NO.2所示；所述纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的重组纤维连接蛋白功能性短体，其特征在于，所述细胞结合肽与纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列之间以连接肽相连接；所述纤维连接蛋白结合胶原蛋白的结构域序列与蛇毒抗菌肽之间以连接肽相连接。3.根据权利要求2所述的重组纤维连接蛋白功能性短体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSNNKGGGGS或GGGGSNNKNNKGGGGS或GGGGSNNKNNKNNKGGGGS中的一种。4.一种编码如权利要求1～3任一项所述的重组纤维连接蛋白功能性短体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.一种重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱雪，何晓燕，王璐，
申请(专利权)人：珠海盈盛联科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：