核苷酸扩增反应制造技术

本发明专利技术涉及核苷酸扩增反应。方法包括使一种多核苷酸与一种扩增试剂混合物混合形成一种反应混合物，其中反应混合物包括在溶解状态下的能可逆结合的二价离子，和调节反应混合物的pH来释放可逆结合的二价离子，从而启动多核苷酸的扩增。苷酸的扩增。苷酸的扩增。

【技术实现步骤摘要】
核苷酸扩增反应
[0001]本申请是申请日为2013年6月7日的中国专利申请201380029231.9“核苷酸扩增反应”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及核苷酸扩增反应。
[0003]背景知识
[0004]很多酶，几乎囊括了所有与核苷酸和大多数蛋白酶互作的酶，都需要二价离子的辅助。例如包含在核苷酸扩增反应中的酶通常需要二价镁离子(Mg++)作为辅助剂。
[0005]核苷酸扩增能够产生非特异性的扩增产物。在很多情况下，这是由于在扩增程序发生之前，非特异的寡核苷酸就可以启动和随后的引物延伸，这是因为所用的酶在室温时通常是有活性的。例如，由于引物二聚体和随后的延伸导致的扩增产物可以经常被观察到。用于克服这个问题的常用方法包括所谓的“热启动”反应，其中被包括在扩增反应中(如酶或二价镁离子辅助因子)的至少一种成分要么与反应混合物分开，要么保持失活状态，直到反应混合物的温度达到适宜的温度。

技术实现思路

[0006]本专利技术是基于，至少部分基于，控制酶促反应改进的方法。
[0007]本专利技术也基于，至少部分基于，核苷酸扩增方法和组成成分的改进，该核苷酸扩增具有利用简单试剂进行热启动的优势。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种方法包括：(a)使多(聚)核苷酸和扩增试剂混合形成反应混合物，其中，反应混合物包括当处于溶液中的可逆结合的二价离子，和(b)调节反应混合物中的pH值来释放该可逆结合的二价离子，从而启动多核苷酸的扩增。
[0009]在一些实施例中，二价离子从下列组合中选择：镁、钙、铜、锌、锰、铁、镉和铅。
[0010]在一些实施例中，二价离子是镁。
[0011]在本专利技术的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种pH敏感螯合剂。这种pH敏感螯合剂可以从下列组合中选择：乙二醇
‑
双(2
‑
氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，EGTA的衍生物，和EDTA的衍生物。优选的溶液中的二价离子能与pH敏感螯合剂可逆结合。优选的pH敏感螯合剂是乙二醇
‑
双(2
‑
氨基乙醚)四乙酸。
[0012]在本专利技术的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种温度敏感缓冲液。在一些实施例中，温度敏感缓冲液可以包括三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)。
[0013]在本专利技术的任意实施例中，反应混合物的pH可以通过温度敏感缓冲液的pH而被调节。
[0014]在本专利技术的任意实施例中，通过改变反应混合物的温度从第一温度到第二温度，反应混合物的pH可以被调节。
[0015]在本专利技术的任意实施例中，在第二温度时温度敏感缓冲液的pKa的值至少低于在
第一温度时温度敏感缓冲液的pKa值的0.4。
[0016]在本专利技术的任意实施例中，温度敏感缓冲液的ApKa值在
‑
0.04℃
‑1和
‑
0.015℃
‑1之间。
[0017]在本专利技术的任意实施例中，第一温度在约0℃和10℃之间，约10℃和20℃之间，或约20℃和30℃之间。优选的第一温度在约20℃和30℃之间。
[0018]在本专利技术的任意实施例中，第二温度在约30℃和40℃之间，约40℃和50℃之间，约50℃和60℃之间，约60℃和70℃之间，约70℃和80℃之间，约80℃和90℃之间，或约90℃和100℃之间。优选的第二温度在约50℃和60℃之间。
[0019]在本专利技术的一些特异实施例中，第一温度在约20℃和30℃之间，第二温度在约50℃和60℃之间。
[0020]在本专利技术的任意实施例中，扩增试剂混合液包括一种切口内切酶，一种DNA或RNA聚合酶，一种重组酶和/或一种逆转录酶。在一些特异实施例中，扩增试剂混合液包括一种切口内切酶和一种DNA或RNA聚合酶。在另一个实施例中，扩增试剂混合液包括一种重组酶和一种DNA或RNA聚合酶。这些实施例可选择性的包括一种逆转录酶。
[0021]在本专利技术的任意实施例中，螯合物试剂浓度与二价离子浓度的比值为约0.5至约2。
[0022]在本专利技术的任意实施例中，在第一温度时游离的二价离子浓度为约0至约10mM之间。
[0023]在本专利技术的任意实施例中，在第二温度时游离的二价离子浓度为约5mM至约50mM之间。
[0024]在本专利技术的任意实施例中，扩增试剂混合物包括一种或多种冻干形式的组分。在特异实施例中，扩增试剂混合物可以包括冻干形式的镁盐。冻干的镁盐可以在缓冲液中复原来形成溶液中的镁离子。在另一些实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种冻干的pH敏感螯合剂。pH敏感螯合剂可以在缓冲液中被复原。根据这些实施例，缓冲液可以是一种温度敏感缓冲液。在一些实施例中，溶液中的镁离子被pH敏感螯合剂可逆结合。根据任意上述的实施例，缓冲液的pH值为了让pH敏感螯合剂与溶液中的游离镁离子可逆结合而为可以控制的。优选的，扩增试剂混合物包括溶液中与pH敏感螯合剂可逆结合的镁离子，其中溶液中的镁离子来自冻干镁盐在温度敏感缓冲液的重新复原。
[0025]在本专利技术的任意实施例中，多核苷酸的扩增可以在基本等温的条件下进行。
[0026]在本专利技术的任意实施例中，多核苷酸在与扩增试剂混合物混合之前不被变性。
[0027]在本专利技术的任意实施例中，混合的步骤可以当温度处于约0℃至10℃之间，约10℃至20℃之间，约20℃至30℃之间进行。优选的混合的步骤在温度处于约20℃至30℃之间进行。
[0028]在本专利技术的任意实施例中，多核苷酸的扩增直到反应混合物的温度处于约30℃至40℃之间，约40℃至50℃之间，约50℃至60℃之间，约60℃至70℃之间，约70℃至80℃之间，约80℃至90℃之间，或约90℃至100℃之间才能发生。优选的多核苷酸的扩增直到反应混合物的温度处于约50℃至60℃之间才能发生。
[0029]在本专利技术的任意实施例中，多核苷酸的扩增可以在没有重复循环处于第一温度和第二温度之间的反应混合物温度时发生。
[0030]在本专利技术的任意实施例中，扩增试剂混合物的一种或多种成分可以被提供在适宜流体装置、盒式或横向流动装置中使用的容器中。
[0031]在本专利技术的任意实施例中，在没有额外的试剂加入到混合步骤(a)中形成的反应混合物，多核苷酸的扩增可以发生。
[0032]在本专利技术的任意实施例中，该方法可以进一步包括步骤(c)：检测扩增的多核苷酸。在本方法的进一步的实施例中包括步骤(c)，在没有额外试剂加入在混合步骤(a)中形成的反应混合物中，扩增的多核苷酸的检测可以进行。
[0033]在本专利技术的任意实施例中，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或基本上所有反应混合物中的二价离子都是可溶形式的。在进一步的实施例中，二价离子被pH敏感螯合剂可逆结合。在进一步的实施例中，二价离子包括游离的二价离子。在另一个实施例中，二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.组合物，其包含一种或多种核酸扩增试剂、温度敏感缓冲液、pH敏感螯合剂和镁盐。2.权利要求1的组合物，其中所述一种或多种核酸扩增试剂包含：(i)切口内切核酸酶、(ii)DNA或RNA聚合酶、(iii)重组酶和/或(iv)反转录酶。3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中一种或多种组分是冻干的。4.权利要求1
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3中任一项的组合物，其中一种或多种组分被提供在盒、微流体装置、横向流动装置或样品制备和转移装置中。5.权利要求1
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3中任一项的组合物，其中一种或多种组分被提供在适宜流体装置、盒或横向流动装置中使用的容器中。6.权利要求1
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5中任一项的组合物，其中pH敏感螯合剂浓度与镁盐浓度的比值约为0.5至约2.0。7.扩增试剂混合物，其包含在溶液中的一种或多种核酸扩增试剂和pH依赖性可逆结合的镁离子。8.权利要求7的扩增试剂混合物，其中所述核酸扩增试剂包含：(i)切口内切核酸酶、(ii)DNA或RNA聚合酶、(iii)重组酶和/或(iv)反转录酶。9.权利要求7的扩增试剂混合物，其包含：(i)切口内切核酸酶和DNA或RNA聚合酶，和任选地反转录酶，或(ii)重组酶和DNA或RNA聚合酶，和任选地反转录酶。10.权利要求7
‑
9中任一项的扩增试剂混合物，其进一步包含温度敏感缓冲液，任选地其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏华，佳露，
申请(专利权)人：爱奥尼安技术公司，
类型：发明
国别省市：