一种恒温扩增的测序方法技术

本申请公开了一种恒温扩增的测序方法。基于修饰了两种引物微球的、可以试管内发生的恒温扩增反应。本发明专利技术的目的是提供一种快速高效、不需要特殊、复杂的建库流程、不需要单独的扩增仪器且与荧光发生等测序方法兼容的试管内进行的恒温扩增技术，通过建好的文库在微球表面的扩增，并将微球固载到基因测序芯片中用于测序。于测序。于测序。

【技术实现步骤摘要】
一种恒温扩增的测序方法


[0001]本专利技术涉及一种恒温扩增的测序方法，属于基因测序领域。

技术介绍

[0002]高通量测序技术是目前生命科学领域常见的分析技术之一，该技术可以将DNA样本片段进行测序，得到对应样本的DNA序列，建立生物表型与基因组、转录组等层面上的联系。现在，第二代测序技术因为其巨大的通量和相对廉价的价格，已经占据了测序领域的绝大部分市场。第二代测序技术的一大特点就是不是对单独的一条DNA进行测序，而是将一条DNA进行扩增几千几万倍后再进行测序和信号采集，而这其中就要用到不同的DNA扩增技术。目前当今世界上的主流测序技术都有着自己对应的特有的扩增技术。Illumina公司可逆末端终止测序技术使用了桥式扩增方法：在平面芯片表面种植两种不同引物后进行桥式PCR并得到DNA簇；ion torrent公司的半导体测序方法对应的是乳液PCR的扩增方法：在形成的乳液内的微球上进行固相PCR，之后再固载到芯片上；华大测序仪则是使用的DNA纳米球的扩增方式：将DNA固载到芯片表面后扩增成一团DNA纳米球。但是这些方法要么直接与现有的荧光发生测序方法不兼容，要么需要特殊且复杂的文库构建过程，要么需要额外的复杂仪器单独进行扩增。
[0003]本专利技术阐述了一种基于固载了两种引物微球的、与荧光发生测序兼容的试管内的恒温扩增方法。本专利技术的目的是提供一种快速高效、不需要特殊、复杂的建库流程、不需要单独的扩增仪器且与荧光发生测序兼容的试管内进行的恒温扩增技术，通过本专利技术荧光发生测序技术可以将建好的文库在微球表面扩增，并将微球固载到测序芯片上进行测序分析。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种恒温扩增的测序方法，在试管等环境中进行恒温扩增，然后将微球固载到芯片上进行测序。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取下述方案：
[0006]本专利技术公开一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包括以下步骤，
[0007]微球与扩增模板形成混合溶液，所述的微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；
[0008]将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
[0009]加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；
[0010]解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；
[0011]加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
[0012]加入剪切试剂，将含有修饰的引物扩增出来的模板剪切为两段；
[0013]加入封端试剂，将微球表面的DNA的3
’
端进行封堵；
[0014]利用微球上的固载用基团将微球固载到基因测序芯片上；
[0015]杂交测序引物；
[0016]测序；
[0017]其中，所述含有DNA聚合酶的反应液中含有DNA聚合酶、dNTP；
[0018]所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。
[0019]根据优选的实施方式，其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。
[0020]本专利技术公开一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包含以下步骤，
[0021]高分子微球与扩增模板形成混合溶液，所述的高分子微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；
[0022]将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；
[0023]加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；
[0024]加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；
[0025]利用微球上的固载用基团将微球固载到基因测序芯片上；
[0026]杂交测序引物；
[0027]测序；
[0028]其中，所述含有DNA聚合酶的反应液中含有DNA聚合酶、dNTP；
[0029]所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。
[0030]根据优选的实施方式，优选地，所述扩增为恒温扩增。
[0031]根据优选的实施方式，所述扩增为RPA、RAA、桥式扩增中的一种。
[0032]根据优选的实施方式，所述RPA扩增的时间为5-90分钟，优选6-40分钟，更优选8-30分钟，更优选10-25分钟。
[0033]根据优选的实施方式，所述扩增引物的长度为20-45bp。
[0034]根据优选的实施方式，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述基因测序芯片上有修饰的链霉亲和素；通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片上。
[0035]根据优选的实施方式，所述微球的直径为0.3-5微米，优选0.5-4微米，更优选1-2微米。
[0036]本专利技术同时公开一种基因测序方法，其特征在于，将待测的DNA分子打断成50-1000bp的片段，作为扩增模板，按照前面任一项所述的方法测序。
[0037]有益效果：
[0038]本专利技术采用一种基于固载了两种引物的微球的试管内的恒温扩增方法。通过控制微球和加入模板的比例，可以使得多数微球上的DNA簇都由同一种模板扩增出来。将扩增后的微球固载到高通量测序芯片上，便可以实现与高通量测序兼容的效果。本专利技术相比于
illumina和ion torrent等公司的扩增方法，不仅快速高效，不需要特殊、复杂的建库流程，也没有PCR的复杂温控流程和乳液扩增的复杂流体装置。并且本专利技术的技术还可以应用于illumina的可逆末端终止测序和ion torrent的半导体测序等其他测序技术。(1)本专利技术直接在固载了两种引物的微球上进行恒温扩增，反应可以直接在试管和EP管等容器内直接进行。(2)本专利技术可以通过控制反应液中的微球密度和模板浓度来控制带有扩增产物的微球数目，通量可控。(3)本专利技术使用的是恒温扩增技术，该技术更加快速高效，对装置的要求更低，不需要PCR的复杂温控流程和乳液扩增的复杂流体装置。(4)本专利技术不需要特殊的、复杂的建库流程，只要在DNA样本两端连接上接头即可，建库流程更方便，操作时间更少。(5)本专利技术中扩增后的微球可以后续固载到芯片表面，这样既可以与荧光发生测序技术兼容，又不破坏芯片坑内外的区分修饰，因此不会影响后续测序时的液封。(6)本专利技术可与其他高通量测序技术兼容，兼容性更强。
附图说明
[0039]图1.扩增流程图。
具体实施方式
[0040]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包括以下步骤，微球与扩增模板形成混合溶液，所述的微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有可被剪切的位点；将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；加入剪切试剂，将含有修饰的引物扩增出来的模板剪切为两段；加入封端试剂，将微球表面的DNA的3
’
端进行封堵；利用微球上的固载用基团将微球固载到基因测序芯片上；杂交测序引物；测序；其中，所述含有DNA聚合酶的反应液中含有DNA聚合酶、dNTP；所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。3.一种恒温扩增的测序方法，其特征在于包含以下步骤，高分子微球与扩增模板形成混合溶液，所述的高分子微球上有两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；将扩增模板杂交到微...

【专利技术属性】
技术研发人员：康力，张晓璐，乔朔，孙文婷，陈子天，段海峰，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：