【技术实现步骤摘要】
本公开涉及基因测序，尤其涉及一种文库扩增单克隆纯度表征方法。
技术介绍
1、现阶段高通量测序技术发展迅速，已成为目前生命研究的常用的分析方法，它具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低的特点，这种技术需要dna文库中的单个分子在带有微反应室(如微坑)的芯片中进行扩增放大信号，从而实现同时检测几十万到几百万的dna分子的目的。
2、在扩增前，需要将dna文库均匀的杂交到带有微坑的芯片表面，而dna文库中的dna分子进入到微坑的数量符合泊松分布，即一定浓度的dna文库随机杂交到芯片的微坑中，使泊松分布的λ为1时(即达到最高单克隆率)，36％的微坑中有1个dna分子，36％的微坑中没有dna分子，28％的微坑中有2个及2个以上的dna分子。
3、在后续的扩增过程中，微坑中的多个分子会同时扩增，产生包含多种dna文库模板的多克隆，会严重影响测序准确度。单克隆纯度低于某一阈值时，将直接影响后续测序信号的分辨，甚至无法达到测序的目的，对测序通量影响很大，因此，亟需要开发一种方法来表征文库扩增后的单克隆纯度。
技术实现思路
1、有鉴于此，本公开实施例提供了一种文库扩增单克隆纯度表征方法，能够对文库扩增后的单克隆纯度进行表征。
2、本公开实施例提供了一种文库扩增单克隆纯度表征方法，采用如下技术方案：
3、所述文库扩增单克隆纯度表征方法包括：
4、步骤s1、设计多种文库，每种文库的标签序列均不同；
5、步骤s2、设计多种测序引物
6、步骤s3、将所述多种文库进行混合，在芯片表面的反应点中进行扩增反应生成扩增产物，不同文库的用量之比的最大值小于5；
7、步骤s4、对所述扩增产物进行处理，生成用于进行测序反应的单链核酸；
8、步骤s5、提供所述多种测序引物中的一种测序引物，与所述单链核酸进行杂交，提供测序反应条件完成n个循环的延伸反应，每个循环延伸的碱基个数为m，收集测序信号，n≥1，m≥1；重复此步骤直至完成所有测序引物的杂交及测序信号的收集；
9、步骤s6、对所述测序信号进行强度提取，得到所述测序信号的强度数据，根据所述强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度。
10、可选地，步骤s1中，所述文库的数量至少为4种，步骤s2中，所述测序引物的数量至少为4种。
11、可选地，步骤s3中，将所述多种文库按相同比例进行混合。
12、可选地，步骤s5中的测序反应为3'端开放的测序反应。
13、可选地，步骤s5中，每个循环延伸的碱基个数为m，m≥3。
14、可选地，步骤s5中，在杂交一种测序引物的过程中，完成的n个循环的延伸反应中，每个循环延伸的碱基个数均相同，n≥2。
15、可选地，步骤s6中，所述根据所述强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度，包括：
16、对所述强度数据进行过滤，根据过滤后的强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度。
17、可选地，所述对所述强度数据进行过滤，包括：
18、根据杂交一种测序引物的过程中，n个循环的强度数据，对所述强度数据进行过滤，n≥2。
19、可选地，所述根据杂交一种测序引物的过程中，n个循环的强度数据，对所述强度数据进行过滤，包括：
20、计算每个反应点内所有测序引物对应的强度数据，确定每个反应点内强度数据最大的第一测序引物，保留所述第一测序引物的n个循环的强度值相差小于10％的反应点的强度数据。
21、可选地，步骤s6中，所述根据所述强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度，包括：
22、对所述强度数据进行过滤后，计算每种测序引物杂交测序过程的n个循环的强度之和，n≥2；
23、选择强度之和最大的测序引物对应的文库为主种；
24、根据主种对应的测序引物的杂交测序过程的n个循环的强度之和，以及所有测序引物的杂交测序过程的n个循环的强度之和，计算得到文库扩增后的单克隆纯度。
25、本公开实施例提供了一种文库扩增单克隆纯度表征方法，该文库扩增单克隆纯度表征方法包括：步骤s1、设计多种文库，每种文库的标签序列均不同；步骤s2、设计多种测序引物，测序引物与文库一一匹配对应，测序引物的3’端序列与文库的标签序列对应，且各测序引物与对应文库杂交后的延伸序列均相同；步骤s3、将多种文库进行混合，在芯片表面的反应点中进行扩增反应生成扩增产物，不同文库的用量之比的最大值小于5；步骤s4、对扩增产物进行处理，生成用于进行测序反应的单链核酸；步骤s5、提供多种测序引物中的一种测序引物，与单链核酸进行杂交，提供测序反应条件完成n个循环的延伸反应，每个循环延伸的碱基个数为m，收集测序信号，n≥1，m≥1；重复此步骤直至完成所有测序引物的杂交及测序信号的收集；步骤s6、对测序信号进行强度提取，得到测序信号的强度数据，根据强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度。通过以上方法能够对文库扩增后的单克隆纯度进行表征，不仅适用范围广，而且检测单克隆纯度的灵敏度较高，同时有助于对芯片有效测序通量做出较为准确的预测。
26、上述说明仅是本公开技术方案的概述，为了能更清楚了解本公开的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为让本公开的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S1中，所述文库的数量至少为4种，步骤S2中，所述测序引物的数量至少为4种。
3.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S3中，将所述多种文库按相同比例进行混合。
4.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S5中的测序反应为3'端开放的测序反应。
5.根据权利要求4所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S5中，每个循环延伸的碱基个数为M，M≥3。
6.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S5中，在杂交一种测序引物的过程中，完成的N个循环的延伸反应中，每个循环延伸的碱基个数均相同，N≥2。
7.根据权利要求6所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S6中，所述根据所述强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度，包括：
8.根据权利要求7所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，所
9.根据权利要求8所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，所述根据杂交一种测序引物的过程中，N个循环的强度数据，对所述强度数据进行过滤，包括：
10.根据权利要求1～9任一项所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤S6中，所述根据所述强度数据，确定文库扩增后的单克隆纯度，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤s1中，所述文库的数量至少为4种，步骤s2中，所述测序引物的数量至少为4种。
3.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤s3中，将所述多种文库按相同比例进行混合。
4.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤s5中的测序反应为3'端开放的测序反应。
5.根据权利要求4所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤s5中，每个循环延伸的碱基个数为m，m≥3。
6.根据权利要求1所述的文库扩增单克隆纯度表征方法，其特征在于，步骤s5中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈晨，乔朔，陈子天，康力，李昂，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。