Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法技术

本发明专利技术提供了由Nb.BsrDI(限制性内切酶)介导的多重交叉置换扩增(multiple cross displacement amplification)新型冠状病毒(SARS

【技术实现步骤摘要】
Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法


[0001]本专利技术公开了一种新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)的检测方法，属于微生 物检测


技术介绍

[0002]新型冠状病毒肺炎(COVID
‑
19)是由SARA
‑
COV
‑
2引起的疾病， SARA
‑
COV
‑
2属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性， 与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat
‑
SL
‑
CoVZC45)同源性达85％以上。SARA
‑
COV
‑
2 传播速度快较快(R
0 3.28)，早期感染患者仍无症状或无特异性临床症状(如咳嗽、 发热、气短等)，难以确诊，暴露至少2天或2周后才出现明显症状。准确、 快速地识别通过近距离接触传播SARS
‑
CoV
‑
2的新冠患者(尤其是无症状感染 者)是控制SARS
‑
CoV
‑
2快速传播的主要挑战之一。
[0003]目前，通过检测SARS
‑
CoV
‑
2的核酸来诊断COVID
‑
19是一种有效的方法。 用于SARS
‑
CoV
‑
2检测的方法主要包括全基因组测序、RT
‑
PCR、等温扩增法、 基因编辑技术、胶体金免疫技术等。全基因组测序对SARS
‑
CoV
‑
2的检测具有 高通量和较好的准确性和精密度，但该方法耗时较长，操作复杂，不适合大规 模检测；RT
‑
PCR对COVID
‑
19感染的诊断具有较高的敏感性、特异性和准确 性，但假阴性检出率较高(仅能检测到约47
‑
60％的阳性COVID
‑
19病例)，检 测耗时约2小时；基因编辑技术具有较高的敏感性和特异性，但需要专用的试 剂和专业人员；免疫胶体金技术和酶联免疫吸附技术缺乏特异性和敏感性；当 前主要的检测方法为RT
‑
PCR法。
[0004]因此，迫切需要建立一种灵敏度高、特异性强、快速的检测方法。等温扩 增技术是一种操作简单、反应时间短、特异性高、灵敏度高的工具，有助于大 规模检测。本专利技术的目的是设计一种新型的诊断COVID
‑
19技术，称为核酸内 切酶限制介导的实时逆转录多重交叉置换扩增(E
‑
rRT
‑
MCDA)。E
‑
rRT
‑
MCDA 方法将等温扩增、逆转录和核酸内切酶酶切与实时荧光分析相结合。

技术实现思路

[0005]基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种限制性内切酶介导的多重交叉 置换扩增目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
[0006](1)提取待检测样品的基因组；
[0007](2)提供置换引物F1和F2；交叉引物CP1和CP2；扩增引物C1和C2， 扩增引物D1和D2，扩增引物R1和R2，同时在所述扩增引物C1、D1或R1 的5
’
端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，所述序列可以被限制性内切酶Nb. BsrDI酶所识别，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团；
[0008](3)在步骤(2)所述引物存在及DNA聚合酶的作用下对步骤(1)获 得的基因组进行恒温扩增靶基因形成双链扩增产物，在本专利技术的一个具体实施 方案中，所述DNA聚合酶为
Bst 2.0；
[0009](4)使用Nb.BsrDI酶对步骤(3)获得的双链扩增产物进行剪切；
[0010](5)检测步骤(4)获得的剪切产物的荧光信号。
[0011]在本专利技术的一个具体实施方案中，使用荧光定量PCR仪检测步骤(3)的 扩增产物的荧光信号，也可以使用实时浊度基因检测系统对对多重交叉置换扩 增之后产物进行扩增效果验证，阳性能产生浊度曲线，阴性无浊度曲线。
[0012]在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述荧光基团为FAM，所述荧光淬 灭基团HBQ1，或者所述荧光基团为CY5，所述荧光淬灭基团HBQ2。在本发 明的具体实施中，上述标记均可以完成检测目的，在同时检测两种不同的目的 基因时，可以对不同的引物组合中的扩增产物标记不同的荧光基团。
[0013]在一个更为优选的实施方案中，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF
‑
F1和ORF
‑
F2；序列分别如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的交叉引物ORF
‑
CP1和ORF
‑
CP2；序列分别如 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF
‑
C1和ORF
‑
C2的扩增引物；序列 分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物ORF
‑
D1和ORF
‑
D2；序 列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF
‑
R1和ORF
‑
R2。 所述的引物组合是用于多重交叉置换扩增新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2) ORF1ab(开放阅读框1a/b)设计的，其中，由于SARS
‑
CoV
‑
2的基因组为RNA， 步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA 的步骤。
[0014]更为优选地，步骤(2)所述扩增引物ORF
‑
D1被标记荧光基团FAM。
[0015]在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的置换引物N
‑
F1和N
‑
F2；序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:14所示的交叉引物N
‑
CP1和N
‑
CP2；序列分别如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO:16所示的N
‑
C1和N
‑
C2的扩增引物；序列分别如SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18所示的扩增引物N
‑
D1和N
‑
D2；序列分别如SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N
‑
R1和N
‑
R2。所述的引物组合是用 于多重交叉置换扩增新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种限制性内切酶介导的多重交叉置换扩增目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供置换引物F1和F2；交叉引物CP1和CP2；扩增引物C1和C2，扩增引物D1和D2，扩增引物R1和R2，同时在所述扩增引物C1、D1或R1的5
’
端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团；(3)在步骤(2)所述引物存在及DNA聚合酶的作用下对步骤(1)获得的基因组进行恒温扩增靶基因形成双链扩增产物；(4)使用Nb.BsrDI酶对步骤(3)获得的双链扩增产物进行剪切；(5)检测步骤(4)获得的剪切产物的荧光信号。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团HBQ1，或者所述荧光基团为CY5，所述荧光淬灭基团HBQ2。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF
‑
F1和ORF
‑
F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的交叉引物ORF
‑
CP1和ORF
‑
CP2；序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF
‑
C1和ORF
‑
C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物ORF
‑
D1和ORF
‑
D2；序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF
‑
R1和ORF
‑
R2，其中，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增引物ORF
‑
D1被标记荧光基团FAM，荧光淬灭基团HBQ1。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的置换引物N
‑
F1和N
‑
F2；序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的交叉引物N
‑
CP1和N
‑
CP2；序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的N
‑
C1和N
‑
C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的扩增引物N
‑
D1和N
‑
D2；序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N
‑
R1和N
‑
R2，其中，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李世军，黄俊飞，任丽娟，蒋维佳，
申请(专利权)人：贵州省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：