基于水解探针法的可同时检测地中海贫血‑α制造技术

本发明专利技术公开了一种基于水解探针法的可同时检测地中海贫血‑α

【技术实现步骤摘要】
基于水解探针法的可同时检测地中海贫血-α21.9缺失型和α2变异的试剂盒
本专利技术涉及医学检测
，具体涉及一种基于水解探针法的可同时检测地中海贫血-α21.9缺失型和α2变异的试剂盒。
技术介绍
地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫。中国人群中，α-地贫的基因型常见的为缺失型--SEA、-α3.7和-α4.2。2013年，钦州市妇幼保健院检测出了一种命名为‘钦州型α地贫缺失型’的罕见地贫基因型，由于该基因型的分子生物学机制为α珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中一段21.9kb的DNA序列的缺失，因此简写为-α21.9(LongJ,YanS,LaoK,PangW,YeX,SunL.Thediagnosisandmolecularanalysisofanovel21.9kbdeletion(Qinzhoutypedeletion)causingα+thalassemia.BloodCellsMolDis.2014；52(4):225-9.)。此外，在申请人的研究过程中，还发现一种新型的α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC。申请人还发现该基因型在广西有一定的分布几率，为对这两种基因型进行检测，需要建立一种可以同时和快速检测HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因-α21.9等位基因的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的可同时检测地中海贫血-α21.9缺失型和α2变异的试剂盒。该试剂盒可以实现单管单次反应直接完成HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC和-α21.9等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。本专利技术所述的基于水解探针法的可同时检测地中海贫血-α21.9缺失型和α2变异的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其中：所述α2变异为α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC，序列具体为：gggttgcgggaggtgtagcgcaggcggcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgtctcagaccaagga；所述的扩增引物为：一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中-α21.9等位基因的特征序列的引物21.9-F和21.9-R，一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，以及一对可以扩增内参基因GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R；所述的荧光探针为：一条特异性检测21.9-F和21.9-R扩增产物的荧光探针21.9-Prob，一条特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob，一条特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob；其中：所述可以扩增α-珠蛋白基因簇中-α21.9等位基因的特征序列的引物对中，21.9-F：5’-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3’；21.9-R：5’-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3’；所述可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2：c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物对中，A2V-F：5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’；A2V-R：5’-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3’；所述可以扩增内参基因GAPDH片段的引物对中，GAPDH-F：5’-CCCCACACACATGCACTTACC-3’；GAPDH-R：5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’；所述特异性检测21.9-F和21.9-R扩增产物的荧光探针21.9-Prob为：21.9-Prob：5’-6-FAM-CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC-BHQ-1-3’；所述的特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob为：A2V-Prob：5’-6-ROX-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3’；所述的特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob为：GAPDH-Prob：5’-CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ-2-3’。本专利技术所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。本专利技术所述的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液。当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaqDNAPolymerase时，缓冲液则优选为与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。采用上述试剂盒快速检测HBA2：c.301-24delinsCTCGGCCC和-α21.9等位基因的方法，包括以下步骤：1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；2)配制反应体系，具体为：将引物21.9-F、21.9-R、A2V-F、A2V-R、GAPDH-F和GAPDH-R，荧光探针21.9-Prob、A2V-Prob和GAPDH-Prob；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；4)数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果，当CY5通道有Cq值读数，则该样本被正常扩增；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道有读数，则表示该样本携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道没有Cq值读数，则表示该样本不携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因；在CY5通道有读数的前提下，若FAM通道有Cq值读数，则本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于水解探针法的可同时检测地中海贫血‑α21.9缺失型和α2变异的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于：所述α2变异为α‑珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301‑24delinsCTCGGCCC；所述的扩增引物为：一对可以扩增α‑珠蛋白基因簇中‑α21.9等位基因的特征序列的引物21.9‑F和21.9‑R，一对可以扩增α‑珠蛋白基因簇中HBA2:c.301‑24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V‑F和A2V‑R，以及一对可以扩增内参基因GAPDH片段的引物GAPDH‑F和GAPDH‑R；所述的荧光探针为：一条特异性检测21.9‑F和21.9‑R扩增产物的荧光探针21.9‑Prob，一条特异性检测A2V‑F和A2V‑R扩增产物的荧光探针A2V‑Prob，一条特异性检测GAPDH‑F和GAPDH‑R扩增产物的荧光探针GAPDH‑Prob；其中：所述可以扩增α‑珠蛋白基因簇中‑α21.9等位基因的特征序列的引物对中，21.9‑F：5’‑GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG‑3’；21.9‑R：5’‑TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG‑3’；所述可以扩增α‑珠蛋白基因簇中HBA2：c.301‑24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物对中，A2V‑F：5’‑GGGTTGCGGGAGGTGTAG‑3’；A2V‑R：5’‑TCCTTGGTCTGAGACAGGTA‑3’；所述可以扩增内参基因GAPDH片段的引物对中，GAPDH‑F：5’‑CCCCACACACATGCACTTACC‑3’；GAPDH‑R：5’‑CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT‑3’；所述特异性检测21.9‑F和21.9‑R扩增产物的荧光探针21.9‑Prob为：21.9‑Prob：5’‑6‑FAM‑CTGGGGAAGGGTGGGTGGGAATAACAGC‑BHQ‑1‑3’；所述的特异性检测A2V‑F和A2V‑R扩增产物的荧光探针A2V‑Prob为：A2V‑Prob：5’‑6‑ROX‑CCTCGGCCCCACTGACCCTC‑BHQ‑1‑3’；所述的特异性检测GAPDH‑F和GAPDH‑R扩增产物的荧光探针GAPDH‑Prob为：GAPDH‑Prob：5’‑CY5‑AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC‑BHQ‑2‑3’。...

【技术特征摘要】
1.基于水解探针法的可同时检测地中海贫血-α21.9缺失型和α2变异的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于：所述α2变异为α-珠蛋白基因簇NG_000006.1中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC；所述的扩增引物为：一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中-α21.9等位基因的特征序列的引物21.9-F和21.9-R，一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，以及一对可以扩增内参基因GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R；所述的荧光探针为：一条特异性检测21.9-F和21.9-R扩增产物的荧光探针21.9-Prob，一条特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob，一条特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob；其中：所述可以扩增α-珠蛋白基因簇中-α21.9等位基因的特征序列的引物对中，21.9-F：5’-GGAGCTTTTCCTTCCCTGGAACG-3’；21.9-R：5’-TGTGGTTGGAGAATGGAGGTGG-3’；所述可以扩增α-珠蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙驹，庞婉容，
申请(专利权)人：钦州市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广西;45