稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及方法与应用技术

本发明专利技术是一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶Hae II对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II。本发明专利技术还公开了稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法与用途。本发明专利技术提供的分子标记特异性高，能明显地将Pi9与存在于该基因组区域内非Pi9基因进行区分。本发明专利技术提供的分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。

【技术实现步骤摘要】
稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及方法与应用
本专利技术属于农业生物
，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记Pi9FNP及其方法与应用。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的稻瘟病害是对水稻生产危害最严重的病害之一，几乎每年都会造成严重的粮食损失。长期的生产实践表明，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最为安全有效的方法。况且由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的35年时间里逐渐丧失，因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。常规抗性基因分析方法需要大量的接种鉴定、抗性遗传及基因等位性分析工作，并且由于不同抗性基因在抗谱上有一定的重叠性，因此常规接种鉴定方法不足以准确、真正地反映出水稻品种的基因型。近一、二十年来，随着水稻抗病分子遗传学的发展，众多的抗性基因得以被精细定位或被克隆，SSR等连锁分子标记的应用大大促进了抗性基因遗传背景的鉴定以及抗病多基因聚合育种的发展(Hittalmanietal.,2000；JenaandMackill,2008)。另一方面，基因克隆的结果显示抗病基因往往是成簇存在，且不同复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以准确甄别各种材料的功能抗病基因(Zhouetal.,2006;Ashikawaetal.,2008;Yuanetal.,2011;Zhaietal.,2011;Huaetal.,2012)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。近年来，有关于Pi2/Pi9等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，王倩等(2012)发现该位点的基因是东北各地区抗性最好、抗谱最广的抗源。张学堂等（2010）和曾凡松等（2011）在各自的研究中也证实Pi2/Pi9等位基因是当前优良的抗性基因。Zhou等（2007）和Dai等（2010）通过对Pi2/Pi9等位位点在5个栽培种及4个野生种的对比研究表明，该位点的基因组结构高度保守，其所属的NBS-LRR类LRR区受到过强正向选择。目前该抗性位点上至今已至少发现有7个不同抗谱的抗性基因（Liuetal.2010;Zhueral.2012），并且有至少5个抗性基因的研究比较清楚，它们分别为Pi2、Piz-t、Pi9、Pi-gm和Pi-50(t)(Quetal.2006;Zhouetal.2006;Dengeta1.2006;Zhuetal.2012),其中Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序列一致性分别都高达96%(Quetal.,2006;Zhouetal.，2006)。Pi9来源于野生稻，能抵抗来自13个国家和地区的43个稻瘟病生理小种的侵染(Liuetal.2002)，国际水稻所用超过100个来自菲律宾的稻瘟病生理小种对携带有抗性基因Pi9的水稻品种75-1-127进行接种鉴定，并没有发现亲和菌株(Quetal.2006)。已有研究开发出一些与Pi9连锁的基于Pi9基因的功能标记和基于PCR技术的分子标记(Liuetal.2002；殷得所等,2011),用于分子标记辅助选择(MAS)育种或品种鉴定工作。然而，前者由于为显性标记，不能鉴别分离世代材料的阳性单株基因型是否纯合;后者与目标基因存在着一定的物理距离，因此，在减数分裂过程中存在着与目标基因发生交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi9应用到水稻抗性育种工作中，将两者的优势结合起来，开发出准确有效的Pi9功能特异性分子标记显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的稻瘟病抗性基因Pi9基因功能特异性分子标记Pi9FNP。本专利技术的另一专利技术目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP的检测方法。本专利技术的再一专利技术目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP的应用。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特点是：通过引物对SEQIDNO.1和SEQIDNO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶HaeII对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II；SEQIDNO.1（5’-3’）:CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；SEQIDNO.2（5’-3’）：CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；所述的核苷酸片段I的序列如下，其中下划线处是Pi9特异碱：基:CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACATGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG所述的核苷酸片段II的序列如下：CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACAGGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG。以上所述的本专利技术稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP技术方案中，进一步优选的技术方案是：其所涉及的水稻品种为选自抗性品种IRBL9-W(Pi9)、C101A51(Pi2)、抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、感病品种日本晴(Nip)、感病品种LTH、感病品种9311。以上所述的本专利技术稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP技术方案中，进一步优选的技术方案是：所述的与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II具体如下：用限制性内切酶HaeII酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小为97bp核苷酸片段；而非稻瘟病基因Pi9则被切成分别为72bp和25bp的核苷酸片段。本专利技术所要解决的另一个技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术还公开了一种如以上技术方案中任何一项所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其特点是：其步骤如下:（1）通过常规PCR法扩增，获得多个Pi9等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；（2）将步骤（1）所得的序列对比，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基SNP差异位点；（3）利用步骤（2）获得的SNP信息，根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，下划线是引入的错配碱基，在该SNP位点下游50100bp处设计基因特异性上游引物，引物对碱基序列如下:SEQIDNO.1（5’-3’）:CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；SEQIDNO.2（5’-3’）：CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；（4）以携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特征在于：通过引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列I，用限制性内切酶Hae II对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与非稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段II；SEQ ID NO.1（5’ ‑3’）:  CGAATTGTAAATAAATGTGGTC；SEQ ID NO.2（5’ ‑3’）： CATAGAATTTCTCCCATTCTGGCGC；所述的核苷酸片段I的序列如下，其中下划线处是Pi9特异碱：基:CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACATGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG所述的核苷酸片段II的序列如下：CGAATTGTAAATAAATG TGGTCGTCTA CCATTAGCAA TACTTACAAT AGGAGCTGTG  CTTGCAACTAAACAGGTGTC  AGAATGGGAGAAATTCTATG。

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9FNP，其特征在于：所述的分子标记Pi9FNP的序列如下：CGAATTGTAAATAAATGTGGTCGTCTACCATTAGCAATACTTACAATAGGAGCTGTGCTTGCAACTAAACATGTGTCAGAATGGGAGAAATTCTATG；其中：稻瘟病抗性水稻品种在下划线处的碱基为T；稻瘟病感性水稻品种在下划线处的碱基为G；所述的稻瘟病抗性水稻品种为IRBL9-W(Pi9)、C101A51(Pi2)、抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)或抗性品种谷梅4号(Pigm)，稻瘟病感性水稻品种为日本晴(Nip)、感病品种LTH或感病品种9311。2.一种如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi9特异性分子标记Pi9FNP的检测方法，其特征在于：其步骤如下:(1)通过常规PCR法扩增，获得多个Pi9等位位点抗性基因和非抗性基因的DNA序列；(2)将步骤(1)所得的序列对比，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基SNP差异位点；(3)利用步骤(2)获得的SNP信息，根据dCAPS标记的设计原理，在所述SNP位点处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，下划线是引入的错配碱基，在该SN...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘辉，査日扬，潘长虹，马永周，樊宁声，潘启民，
申请(专利权)人：连云港市农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32