一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，包括如下步骤：引发核酸探针之间的杂交链式反应，留取杂交链式反应的上清液；在上清液中，制备核酸铂纳米复合材料；制备显色底物；把显色底物引入核酸铂纳米复合材料进行显色反应以进行核酸浓度的检测。与现有技术相比，本发明专利技术阐明了基于核酸铂纳米材料的自组装体系的核酸浓度的检测机理，本发明专利技术所述的检测核酸浓度的方法，实现目标核酸的比色检测，大大缩短了检测时间，同时可采用紫外吸光度的测量，进行核酸浓度的精确检测，提高了检测灵敏度，其对于目标核酸具有很好的选择性和特异性，设计和操作过程都十分简便、成本低廉、又兼顾较好的灵敏度，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法。
技术介绍
核酸在生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动中起着非常重要的作用。其含量的多少或序列的突变都可能导致各种疾病的发生。人类基因组计划完成后，分析研究特定序列核酸和基因突变的检测研究，尤其是研究基因突变与人类重大疾病之间的关系变得越来越重要。目前，大量的核酸扩增技术的相继报道，例如聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)、环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)、依赖于核酸序列的扩增技术(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)、滚环扩增技术(Rollingcircleamplification,RCA)等为核酸灵敏检测提供有力的手段。然而，这些扩增技术往往依赖特定的温度以及限制其他反应条件来保证扩增有效运行。这也给实际操作带来很大的麻烦，同时增加研究的成本支出。然而，杂交链式反应(Hybridizationchainreaction,HCR)作为一种无酶等温核酸扩增技术，该反应依赖引发探针、两种带有粘性末端的发夹环单体探针链。若无引发序列存在时，二者可稳定存在于溶液中。当经引发探针触发后，发卡型结构依次打开形成具有多个重复单元的交替共聚物。由于杂交链式反应不需要酶的加入，以核苷酸链作为引发剂诱导链聚合，反应条件温和，操作简单，可适用于其他传感器的信号放大。目前，众多纳米材料如金属氧化物、金属纳米颗粒、碳基纳米材料(石墨烯、碳量子点、碳纳米管等)和这些材料相互结合形成的复合型纳米材料等已被证实具有优越的类过氧化物酶活性，并且被广泛用于各种生物传感策略中。同时，由于纳米人工酶具有纳米材料和天然酶的双重优越特性，在发展纳米酶来替代传统的蛋白酶生物分析研究中具有广阔的应用前景。此外，核酸和纳米材料之间的自组装体系可以完美的将纳米材料自身良好的光学、电磁学、以及催化性能与核酸有序组装特性和序列特异性识别能力相互融合，从而在分析检测中获得优越的信号识别和信号放大效果。中国专利CN104007152A公开了基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法，其公开了DNA可与铂纳米粒子发生自组装反应，铂纳米粒子的制备方法是采用柠檬酸钠和HPtCl6制备方法，但该过程需制备电化学传感器，制备时间为24h，存在检测时间长的缺点。中国专利CN103820541A公开了一种基于指数发卡组装和比色快速检测核酸的方法，且具体公开了目标核酸分子与修饰了DNA的纳米金通过剪辑互补配对使目标核酸分子的一端固定在纳米金上，固定在纳米金上的目标核酸分子引发发卡DNA发生自组装反应，在上述体系中加入二价或一价阳离子盐，可使纳米金产生聚沉，颜色从红色到蓝色变化，加入的目标核酸分子越多，颜色越红，加入的目标核酸分子越少，颜色越蓝，实现了肉眼可视化检测，同时可利用紫外可见吸收装置对其进行紫外吸收检测，检测效果及准确度均较高。但目前还没有关于基于核酸和铂纳米材料的自组装体系与显色反应结合的核酸浓度的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，该方法结合显色底物的显色反应，能快速实现核酸浓度的可视化检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，包括如下步骤：引发核酸探针之间的杂交链式反应，留取杂交链式反应的上清液；在上清液中，制备核酸铂纳米复合材料；制备显色底物；把显色底物引入核酸铂纳米复合材料进行显色反应以进行核酸浓度的检测。优选的，所述杂交链式反应包括以下步骤：步骤1、分别配制预定浓度的核酸探针发夹环H1、发夹环H2、目标核酸和末端修饰生物素的探针链，分别在95度水浴中保持5min，随后再缓慢冷却至室温；步骤2、目标核酸和探针链在Tris-HCl反应液中形成部分互补的杂交体系，于37度下反应1h；步骤3、将发夹环H1、发夹环H2溶液加入到反应液中，水浴37度下杂交链式反应1.5h；步骤4、将链霉亲和素修饰的磁珠加入到反应液中，37度水浴下反应1h；步骤5、在磁铁吸附下从反应溶液中移除磁珠，并保留反应液的上清液作为制备核酸铂纳米复合材料的反应液。优选的，在所述杂交链式反应的步骤2中，Tris-HCl反应液含有20mMTris-HCl、300mMNaCl、50mMMgCl2·6H2O，所述Tris-HCl反应液的PH值为7.5。优选的，所述核酸探针发夹环H1、发夹环H2的浓度均为0.06uM，所述目标核酸的浓度为0.25～8uM，所述末端修饰生物素的探针链的浓度为0.01uM。优选的，所述核酸铂纳米复合材料的制备包括如下步骤：步骤一、将上清液加入到离心管中，滴加铂前驱体物质，将离心管离心振荡5s,并室温下培育2min；步骤二、将新鲜配置的硼氢化钠溶液快速滴加到离心管中，离心振荡5s，并在室温下静置反应4-5min，获得核酸铂纳米复合材料。优选的，所述铂前驱体物质是K2PtCl4，其浓度为80uM。优选的，所述显色底物为TMB/H2O2溶液，其组成如下：20mMMES-HAc(140mMNaAc，PH4.0)溶液中含有2％v/vTMB(30mM)和2％/vH2O2(30wt％)。优选的，所述显色反应的步骤如下：在核酸铂纳米复合材料中引入TMB/H2O2溶液，室温下反应4-5min，随后加入浓硫酸终止反应，显色底物从无色到蓝色发生变化，颜色的深度与目标核酸的浓度成反比。优选的，所述浓硫酸的浓度为3～5M，更优选4M。优选的，在显色反应终止后加入水溶液并置于紫外仪器上检测紫外吸光度值，间接检测溶液中目标核酸的浓度。优选的，所述紫外吸光度值与目标核酸的浓度对数值之间为线性关系。优选的，所述紫外仪器能够实现对0.228uM目标核酸浓度的检测。在本专利技术中，我们发现当核酸作为模板元件原位合成铂纳米材料时，该非共价自组装复合物体系几乎没有任何类过氧化物酶活性。另外，当体系中不存在核酸时最终制备得到的铂纳米材料则表现了优越的酶催化活性。为实现上述技术方案，本专利技术采用如下机理：大多数与铂纳米相关的材料都具备优异类似过氧化氢酶活性，可以快速催化TMB/H2O2底物生成蓝色可见的沉淀物。大分子核酸可以通过非公价相互作用快速与铂前驱体分子(K2PtCl4)结合，当强还原剂硼氢化钠加入后会催化这些铂前驱体分子以核酸分子为模板快速生成核酸铂纳米复合材料(DNA-Pthybridnaomaterials)。由于核酸大分子的空间位阻效应导致核酸铂纳米复合材料表面活性位点被大量包覆，使得核酸铂纳米复合材料的酶催化活性被有效抑制。失去酶活性的核酸铂纳米复合材料不能够有效地催化TMB/过氧化氢H2O2底物溶液产生颜色响应。本专利技术所述的检测方法主要通过目标核酸部分序列驱动发夹环核酸探针之间发生杂交链式反应(Hybridizationchainreaction,HCR)，同时靶核酸链又可以连接末端修饰生物素的探针链，最终形成的长链体系可通过链霉亲和素修饰的磁珠进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：引发核酸探针之间的杂交链式反应，留取杂交链式反应的上清液；在上清液中，制备核酸铂纳米复合材料；制备显色底物；把显色底物引入核酸铂纳米复合材料进行显色反应以进行核酸浓度的检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：引发核酸探针之间的杂交链式反应，留取杂交链式反应的上清液；在上清液中，制备核酸铂纳米复合材料；制备显色底物；把显色底物引入核酸铂纳米复合材料进行显色反应以进行核酸浓度的检测。2.根据权利要求1所述的一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述杂交链式反应包括以下步骤：步骤1、分别配制预定浓度的核酸探针发夹环H1、发夹环H2、目标核酸和末端修饰生物素的探针链，分别在95度水浴中保持5min，随后再缓慢冷却至室温；步骤2、目标核酸和探针链在Tris-HCl反应液中形成部分互补的杂交体系，于37度下反应1h；步骤3、将发夹环H1、发夹环H2溶液加入到反应液中，水浴37度下杂交链式反应1.5h；步骤4、将链霉亲和素修饰的磁珠加入到反应液中，37度水浴下反应1h；步骤5、在磁铁吸附下从反应溶液中移除磁珠，并保留反应液的上清液作为制备核酸铂纳米复合材料的反应液。3.根据权利要求2所述的一种基于核酸和铂纳米材料的自组装体系检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤2中的Tris-HCl反应液含有20mMTris-HCl、300mMNaCl、50mMMgCl2·6H2O，所述Tris-HCl反应液的PH值为7.5。4.根据权利要求1所述的一种基于核酸和铂纳米材料的自组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟伟，方雪恩，李花，曹宏梅，王欣珍，杨茜，王丽娟，孔继烈，
申请(专利权)人：复旦大学，上海速创诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31