鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用技术

本发明专利技术公开了鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用,分子标记为根据目的基因关键特异性位点设计引物Cf-5-Al lele-F1、引物Cf-5-Al lele-F2和引物Cf-5-R，利用引物末端碱基特异匹配对目的基因进行基因分型；本发明专利技术采用PCR的SNPLine平台是高通量的分子标记系统，所以能实现操作流程全自动，降低人为误差；分析通量高，每天可完成五十万个SNP基因型分型，适合大量样品同时检测。基于番茄叶霉病抗病基因Cf-5设计的高通量检测的KASP分子标记，并应用于番茄叶霉病抗病植株的高通量筛选与鉴定，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，对培育抗叶霉病的番茄优良品种、有效控制番茄叶霉病的危害，具有重要意义，也是一项重要的育种方法创新和技术创新。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业生物
，涉及一种用于鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用。
技术介绍
番茄是我国重要的蔬菜作物之一，在保护地蔬菜生产中占有非常重要的地位。番茄叶霉病(CladosporiumfulvumCooke)是威胁保护地番茄生产的世界性病害之一，严重影响番茄的品质，导致番茄减产，给保护地番茄生产带来巨大损失。番茄叶霉病于1883年在英国首次被报道，因流传速度快，短时间内可爆发成灾，很快便受到科学家们的高度重视。番茄叶霉病于20世纪30年代在台湾发生后，在我国大陆陆续发生，随着保护地面积的扩大，其危害性愈专利技术显。近年来，国内外科学家对番茄叶霉病进行了深入而广泛的研究和探索。研究表明，培育叶霉病抗病品种是防治番茄叶霉病最有效的途径。随着研究的进展，多个番茄叶霉病抗病基因已经被鉴定和克隆。其中，Cf-5基因是重要的番茄叶霉病抗病基因之一。在国内外培育的众多抗病番茄品种中，Cf-5发挥着不可替代的作用。因此，开发Cf-5高效分子标记尤为重要。Wordregen等(1994)利用分子标记作图在“WSL6”番茄中开发了与Mi和Cf-2/Cf-5紧密连锁的SCAR分子标记REX-1。但是，Mi基因与Cf-5基因存在一定程度上的重组，严重影响分子标记REX-1的选择准确性。于栓仓等(2005)根据Cf-5基因序列开发了共显性CAPS分子标记，此标记需要酶切，成本高、实验程序繁琐、检测效率低。综上所述，目前，番茄育种仍缺乏准确且高效的Cf-5基因的分子标记，严重影响番茄抗叶霉病品种的育种效率。因此，开发准确、高效且实用性强的Cf-5高通量分子标记，对培育抗番茄叶霉病优良品种，有效控制番茄叶霉病的危害，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有技术中需要酶切，成本高，实验程序繁琐，检测效率低等不足与缺陷，提供一种成本低、快捷高效、准确率高的鉴定番茄叶霉病抗性基因Cf-5的高通量分子标记及其标记方法与应用。本专利技术技术方案如下：本专利技术提供的用于检测抗性基因Cf-5的高通量分子标记包括引物Cf-5-Allele-F1、引物Cf-5-Allele-F2和引物Cf-5-R。引物为包含以下序列的引物，序列如下：Cf-5-Allele-F1：5’–GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’(下划线部分为FAM荧光标签序列)Cf-5-Allele-F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’(下划线部分为HEX荧光标签序列)Cf-5-R：5’–CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’更加具体的，设计引物Cf-5-F1、引物Cf-5-F2、引物Cf-5-R，并在上述引物Cf-5-F1和引物Cf-5-F2的5’端分别加上相应的荧光标签序列。其中，引物Cf-5-F1、引物Cf-5-F2、引物Cf-5-R为包含以下序列的引物：Cf-5-F1：5’–GCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’Cf-5-F2：5’–GCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’Cf-5-R：5’–CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’优选的，荧光标签序列为：Cf-5-F1adaptor：5’–GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(FAM荧光标签序列)Cf-5-F2adaptor：5’–GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(HEX荧光标签序列)优选的，分子标记引物为：Cf-5-Allele-F1：5’–GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’(下划线部分为FAM荧光标签序列)Cf-5-Allele-F2：5’–GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’(下划线部分为HEX荧光标签序列)Cf-5-R：5’–CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’本专利技术还提供了一种鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记方法，主要步骤为：a使用CTAB法提取番茄全基因组DNA；b利用引物Cf-5_Allele-F1、引物Cf-5_Allele-F2和引物Cf-5-R以番茄全基因组DNA为模板进行PCR扩增；c对PCR扩增产物进行荧光扫描；d分析等位基因分型结果。优选的，上述步骤b中PCR反应体系为KASP基因分型PCR反应体系:5ngDNA，0.07ulKASP72×assaymix，2.5ulKASPV4.02×MasterMix，加ddH2O至5ul。优选的，上述KASP基因分型PCR反应体系中KASP72×assaymix由浓度为100uM的引物Cf-5_Allele-F1、引物Cf-5_Allele-F2和引物Cf-5-R与ddH2O按12︰12︰30︰46的体积比混合得到。KASP基因分型PCR反应体系中KASPV4.02×MasterMix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，高保真酶和dNTP组成。上述荧光探针A为：在5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’的5’末端连接1个FAM荧光基团；荧光探针B为：在5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’的5’末端连接1个HEX荧光基团；淬灭探针A为：在5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’的3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B为：在5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’的3’末端连接淬灭基团BHQ。扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃20s，65-55℃(每个循环降1.0℃)1min，共10个循环；阶段3：94℃20s，55℃1min，共26个循环。优选的，步骤d中对等位基因分型及结果分析：将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据扫描结果分析番茄Cf-5基因型。若所述待测番茄扩增产物荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测番茄Cf-5基因型为T︰T，即为番茄叶霉病抗病植株；若呈现红色，则基因型为C︰C，即为感病植株；若呈现绿色，则基因型为T︰C，即为杂合抗病植株。本专利技术还提供了用于鉴定番茄叶霉病抗性基因Cf-5的高通量分子标记在抗番茄叶霉病品种选育中的应用。由于采用了上述技术方案，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记，其特征在于：所述分子标记是通过设计引物Cf‑5‑F1、引物Cf‑5‑F2和引物Cf‑5‑R；所述引物Cf‑5‑F1和所述引物Cf‑5‑F2在5’端加上相应的荧光标签序列后，与所述引物Cf‑5‑R一起实现的；所述引物Cf‑5‑F1、引物Cf‑5‑F2和引物Cf‑5‑R为包含以下序列的引物：Cf‑5‑F1：5’‑GCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT‑3’；Cf‑5‑F2：5’‑GCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC‑3’；Cf‑5‑R：5’‑CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG‑3’。

【技术特征摘要】
1.鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记，其特征在于：所述分子标记是通过
设计引物Cf-5-F1、引物Cf-5-F2和引物Cf-5-R；所述引物Cf-5-F1和所述
引物Cf-5-F2在5’端加上相应的荧光标签序列后，与所述引物Cf-5-R一起
实现的；所述引物Cf-5-F1、引物Cf-5-F2和引物Cf-5-R为包含以下序列的
引物：
Cf-5-F1：5’-GCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’；
Cf-5-F2：5’-GCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’；
Cf-5-R：5’-CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’。
2.如权利要求1所述的鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记，其特征在于：
所述荧光标签序列为：
Cf-5-F1adaptor：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，FAM荧光标签序列；
Cf-5-F2adaptor：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，HEX荧光标签序列。
3.如权利要求2所述的鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记，其特征在于：
所述分子标记的引物为：
Cf-5-Allele-F1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT-3’；
Cf-5-Allele-F2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC-3’；
Cf-5-R：5’-CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG-3’。
4.鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记方法，其特征在于：
a使用CTAB法提取番茄全基因组DNA；
b利用权利要求3所述的引物Cf-5-Allele-F1、引物Cf-5-Allele-F2和引
物Cf-5-R以番茄全基因组DNA为模板进行PCR扩增；
c对PCR扩增产物进行荧光扫描；
d分析等位基因分型结果。
5.如权利要求4所述的鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记方法，其特征在
于：所述步骤b中PCR反应体系为KASP基因分型PCR反应体系:5ngDNA，
0.07ulKASP72×assaymix，2.5ulK...

【专利技术属性】
技术研发人员：程琳，张生，国家进，陈福东，张晓燕，董甜，李晓杰，刘岳，王如芳，董静，于彩玉，
申请(专利权)人：山东寿光蔬菜种业集团有限公司，山东省寿光蔬菜产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37