一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg

Nucleic acid self assembly composite nano flower granular material, preparation method and application thereof

The invention belongs to the technical field of biology, in particular to a nucleic acid self assembled composite nano flower granular material, a preparation method and an application thereof, wherein the self assembled composite material is a contractive nucleic acid and a Mg

【技术实现步骤摘要】
一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种自组装复合材料及其制备方法和应用，具体涉及一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用。
技术介绍
癌症是目前威胁人类生命健康的头号疾病。从根本上讲，癌症是一种复杂的基因疾病，DNA是最重要的生物大分子，是自然选择的存储生物基因信息的大分子。由于特异性极高的Watson-Crick碱基相互作用，上个世纪90年代，纽约大学的Seeman教授发现可利用DNA可控自组装构筑二维及三维纳米结构，从而开启了DNA纳米技术的发展。DNA大分子作为纳米药物载体具有其它技术所无法比拟的优势：(1)完全地生物可降解性，生物相容性好。(2)纳米尺寸可调。(3)DNA是最为智能的材料：能够响应外界刺激发生二级结构的变化；能够实现程序化设计；一些特殊的单链DNA具有类似于抗体(antibody)和酶(enzyme)的功能性，例如对细胞表面癌症标记物有特异性识别的适体序列(aptamer)。(4)对DNA进行化学修饰的方法比较成熟。(5)DNA大分子的可操控性能比较强，可以通过特异识别序列的引入，利用酶活性实现对DNA大分子的复制(polymerase)、剪切(restrictionendonuclease)和粘结(ligase)。在一定条件下，恒温滚环扩增反应(rollingcircleamplification,RCA)进行足够长的时间，生成的高分子量的DNA/RNA产物会自组装成纳米结构。RCA反应以环状DNA/RNA为模板，在聚合酶的作用下通过链置换反复、持续地复制模板序列，是制备具有特定序列的高分子量DNA/RNA简单有效、成本低廉的方法。表征分析显示这种纳米粒子的最重要成分是产物DNA/RNA，而脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在聚合过程中产生的焦磷酸镁(Mg2PPi)是DNA/RNA的主要缩合剂(condensationagents)，通过静电相互作用使DNA/RNA紧密聚集成纳米颗粒。通常电荷数≥3的多价阳离子(polycation)，例如Co(NH3)63+、聚胺、聚电解质、多肽等，是常用的缩合剂。然而，以恒温滚环扩增反应制备DNA大分子为载体是制备纳米药物很好的思路，关于这方面的研究才刚刚起步，还有多问题需要解决和改进；例如：(1)人们得到的DNA纳米粒子是恒温滚环扩增反应的直接产物，虽然对其生成的机理已经有一定的讨论，但是如何可控地制备这种纳米粒子，对其尺寸和形貌进行有效调控仍然是攻关的难点；(2)这类DNA纳米粒子仍然不能直接穿越细胞膜，需要在其表面修饰一层正电性高分子，这样的设计大大降低了用DNA大分子作为药物载体的意义；(3)选用和DNA类似的生物材料修饰并稳定DNA纳米粒子是目前需要解决的另一问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种自组装复合材料，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg2P2O7共结晶形成的纳米花颗粒，所述颗粒的粒径小于500nm。本专利技术中，通过引入阳离子通过静电作用使长链螺旋状核酸由于电荷中和发生不同程度的收缩，当引入P2O74-后在收缩的阳离子/核酸系统中会原位的生成Mg2PPi晶体，最终形成Mg2PPi/DNA-NFs，焦磷酸镁(Mg2PPi)是核酸的主要缩合剂，通过静电相互作用使核酸紧密聚集成纳米花颗粒，所述纳米花颗粒即纳米颗粒呈现花状结构，具有针状或片状的花瓣，所述颗粒的直径例如可以是100nm、120nm、150nm、160nm、180nm、200nm、210nm、230nm、250nm、280nm、300nm、320nm、350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、430nm、450nm、480nm或500nm，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。优选地，所述颗粒的粒径为100-500nm，优选为300-500nm。本专利技术中，Rg为动力学半径，Rh为流体力学半径，Rg/Rh为0.775说明自组装材料为致密的球状结构，随着本专利技术阳离子含量的增加，Rg值从92.9nm减小到了75.3nm，说明阳离子Mg2+使核酸链有一个收缩的过程，当用P2O74-把缩合的核酸形状固定以后，就形成了SEM可观测的自组装纳米花复合材料结构。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的自组装复合材料的制备方法，包括如下步骤：向核酸水溶液中加入阳离子反应后，再加入焦磷酸盐，制备得到所述自组装复合材料。根据本专利技术，所述核酸为单链DNA和/或RNA，本领域中能够制备得到单链DNA的方式都是可行的，本领域技术人员可以根据实际需要采用本领域公知的技术进行制备，在此不做特殊限定。本专利技术中，在制备所述自组装复合材料之前，将核酸进行扩增，具体采用滚环扩增技术，具体的，以线性单链模板DNA/RNA与引物(一条寡聚核酸同模板序列首尾互补)相互识别，首尾两端闭合成环，在连接酶的作用下连接成环状单链DNA/RNA；进一步，在聚合酶以及dNTPs存在的条件下，从引物开始复制环状模板，通过链置换作用进行无限单链扩增，产生具有重复模板序列的长单链核酸分子。根据本专利技术，所述制备方法中的核酸分子为长单链核酸分子，分子链过短无法形成本专利技术的纳米花的自组装复合材料，所述核酸的碱基数量为1000-12000bp，例如可以是1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、4500bp、5000bp、5500bp、6000bp、6500bp、7000bp、7500bp、8000bp、8500bp、9000bp、9500bp、10000bp、11000bp或12000bp，优选为2000-10000bp，进一步优选为10000bp，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。根据本专利技术，所述阳离子起到中和核酸电荷的作用，所述阳离子为Mg2+、Ca2+、Zn2+或Fe2+中的任意一种或至少两种的混合，优选为Mg2+，选优述Mg2+是由于本专利技术所述自组装复合材料后期要用于载药进入人体，而人体中本身就含有Mg2+，Mg2+对人体友好，无毒无刺激无副作用，不会造成排斥，而且在RCA反应的过程中，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在聚合过程中产生的焦磷酸镁(Mg2PPi)是DNA/RNA的主要缩合剂(condensationagents)，通过静电相互作用使DNA/RNA紧密聚集成纳米颗粒，所以在研究纳米花的形成机理时，用Mg2+和P2O74-模拟RCA反应中形成的Mg2PPi。优选地，所述焦磷酸盐为焦磷酸钠、焦磷酸钾或焦磷酸铵中的任意一种或至少两种的混合。根据本专利技术，所述自组装复合材料的制备方法，包括以下步骤：(1)配制核酸水溶液，向核酸水溶液中加入阳离子溶液反应后，调节pH孵育；(2)向步骤(1)的混合物中分次加入焦磷酸盐，超声，经过多次加热冷却后进行孵育；(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。优选地，步骤(1)所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自组装复合材料，其特征在于，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg

【技术特征摘要】
1.一种自组装复合材料，其特征在于，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg2P2O7共结晶形成的纳米花颗粒，所述颗粒的粒径小于500nm。2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述颗粒的粒径为100-500nm，优选为300-500nm；优选地，所述核酸收缩后为球形结构，所述核酸收缩后的Rg/Rh为0.775。3.一种如权利要求1或2所述的自组装复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：向核酸水溶液中加入阳离子反应后，再加入焦磷酸盐，制备得到所述自组装复合材料。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为单链DNA和/或RNA；优选地，所述核酸的碱基数量为1000-12000bp，优选为2000-10000bp，进一步优选为10000bp；优选地，所述阳离子为Mg2+、Ca2+、Zn2+或Fe2+中的任意一种或至少两种的混合，优选为Mg2+；优选地，所述焦磷酸盐为焦磷酸钠、焦磷酸钾或焦磷酸铵中的任意一种或至少两种的混合。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制核酸水溶液，向核酸水溶液中加入阳离子溶液反应后，调节pH孵育；(2)向步骤(1)的混合物中分次加入焦磷酸盐，超声，经过多次加热冷却后进行孵育；(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。6.根据权利要5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸水溶液的质量浓度为0.01-2mg/mL，优选为0.04-1mg/mL，进一步优选为0.1mg/mL；优选地，步骤(1)所述核酸和阳离子的摩尔比为1:(10-1500)，优选为1:(100-300)，进一步优选为1:200；优选地，步骤(1)所述的pH为6-9，优选为7-8.5，进一步优选为8；优选地，所述孵育的温度为20-40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃；优选地，所述孵...

【专利技术属性】
技术研发人员：田雷蕾，袁雪霞，邵晨，赵浩然，徐婧媛，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东,44