本发明专利技术的一个目的是提供一种准确、快速区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系。该鉴定体系包括毛干纤维预处理和DNA提取方法，准确、快速鉴定毛干纤维物种来源的PCR引物对和系统判定毛干纤维物种来源的方法。本鉴定体系结合通用引物扩增、测序和特异引物扩增检测的方法，准确、快速判定样本保存状况、是否混合及具体物种来源，实现快速而准确的毛干纤维样品的物种来源鉴定。本发明专利技术提供的分子鉴定体系能够灵敏、准确且快速地区别不同物种来源的动物毛干纤维，该鉴定体系设计严谨、技术常规、体系标准化，可以作为一种毛纺检测技术在纺织及质控领域内广泛推广应用，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系
技术介绍
动物毛纤维的种类很多，最主要的是绵羊毛和山羊绒，他们都被广泛用于制造各种纺织品。除此之外，常用于制造纺织品的动物毛还包括骆驼毛、牦牛毛等。在现代工艺中，既可使用单一动物毛纤维纯纺，也可以使用几种动物纤维进行混纺。在混纺中，利用不同毛各自特有的光泽、细度和柔软性，可使织物呈现不同程度的保暖性和手感，满足消费者的多层次需求。但是，由于不同动物来源的纤维存在价格差异，在市场上有部分生产者为了降低成本，将外观相似的或经处理的他源动物毛纤维混入织物中，制作假冒产品，严重损害了消费者的利益。因此，迫切需要在毛纺质控领域内建立起准确、快速检测动物毛物种来源的鉴定体系。目前的动物毛纤维物种来源鉴别方法主要有形态特征分析法、化学分析法、光谱分析法、计算机图像分析法和蛋白结构分析法等。但是动物毛纤维均由角化细胞构成，不同物种来源的毛纤维理化性质差异并不大，并且欠缺科学的鉴定指标。DNA是生物的遗传信息载体，随着分子生物技术的发展，DNA信息分析在多个领域被应用于物种鉴定。以DNA为基础的分子遗传分析方法具有灵敏、准确且稳定的特征。动物线粒体基因在进化上相对保守，因此被广泛应用于物种鉴定。动物线粒体基因组多拷贝的存在线粒体中，因此更加适合应用于分析从经处理的动物毛干中获得的DNA的检测工作。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种准确、快速区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系。本专利技术所提供的技术体系包括：1)毛干纤维预处理方法和DNA提取方法；准确、快速鉴定毛干纤维物种来源的PCR引物对，包括根据多物种线粒体同源基因DNA序列设计的通用引物P1、羊通用引物P2、及针对牦牛(P3)、骆驼(P4)、绵羊(P5)、山羊(P6)四种不同物种来源设计的特异引物；系统判定毛干纤维物种来源的方法，包括结合PCR扩增电泳结果、测序峰图及序列比对系统判定动物毛干纤维的物种来源。2)毛干纤维预处理方法为将动物毛干纤维剪碎后使用无水乙醇浸泡30分钟后更换无水乙醇再浸泡30分钟，再使用ddH2O浸泡30分钟后两次更换ddH2O并分别浸泡30分钟，之后将水倒掉并晾干；毛干纤维DNA提取方法为在将处理后的毛干纤维震荡消化至毛干纤维完全消失后，加入2μL浓度为1μg/μL的PolyAcarrierRNA作为DNA共沉淀剂提高毛干纤维中DNA的获得率，再使用硅胶吸附法提取毛干纤维中的DNA。3)准确、快速鉴定毛干纤维物种来源的PCR引物对，包括根据多物种线粒体同源基因DNA序列设计的通用引物P1，其序列为P1F：5’-GTAAATCTCGTGCCAGCCA-3’和P1R：5’-CACCGCCAAGTCCTTTGAG-3’；羊通用引物P2，其序列为P2F：5’-GTCCACTAGATCACGAGCTT-3’和P2R：5’-CAAGATGCAGTTAAGTCCAG-3’；牦牛特异引物P3，其序列为P3F：5’-AGTACATAATTCCTATTGGTAG-3’和P3R：5’-CATTGACTATATGTGCATGCC-3’；骆驼特异引物P4，其序列为P4F：5’-AGCGTGTTAATGAGTGACTA-3’和P4R：5’-TTGTTGGTAATCACCTAGGT-3’；绵羊特异引物P5，其序列为P5F：5’-GCATGTACATTTGTTTCACTG-3’和P5R：5’-CATAGCTGAGTCCAAGCATC-3’；山羊特异引物P6，其序列为P6F：5’-CGTACAATGTCCTTATTAGC-3’和P6R：5’-GTGGAGCGAATGCATGGTGA-3’。4)系统判定毛干纤维物种来源的方法，包括判定体系中通用引物扩增、测序的判定方法：对于物种样本来源完全未知的样本，使用多物种线粒体同源基因通用引物P1扩增待测样本DNA并测序；对于判定羊源成分的样本，使用羊通用引物P2扩增待测样本DNA并测序；通过分析测序峰图在关键位点是否存在套峰判定样本是否为混合成分样本；若测序峰图无套峰，则可通过将测得的序列与各物种保守序列进行比对，判定样本的物种来源。5)系统判定毛干纤维物种来源的方法，包括判定体系中特异引物扩增的判定方法其特征在于：对于测序峰图为套峰的样本，使用体系中设计的特异引物P3、P4、P5、P6分别扩增样本DNA，若待测样品被两种或两种以上特异引物扩增获得明显条带，则说明所述待测样品为多物种来源成分混合样品，且来源于特异引物阳性扩增所对应的物种；同时，对于保存状况较好的样本，直接使用体系中设计的特异引物P3、P4、P5、P6分别扩增样本DNA，若待测样品仅分别被牦牛、骆驼、绵羊、山羊特异引物扩增获得明显条带，则说明所述待测样品的物种来源单一，分别为牦牛、骆驼、绵羊、山羊，实现快速鉴定。本专利技术建立分子鉴定体系结合通用引物扩增、测序和特异引物扩增检测的方法，准确、快速判定样本保存状况、是否混合及具体物种来源，实现快速而准确的毛干纤维样品的物种来源鉴定，具有特异性强、灵敏度高的特征，能够快速、准确、客观的实现动物毛干纤维物种来源的鉴定工作，在毛纺领域内具有广泛的应用前景。附图说明图1为通用引物鉴定毛、绒样品结果。图2为羊通用引物鉴定毛、绒样品结果。图3为牦牛引物鉴定毛、绒样品结果。图4为骆驼引物鉴定毛、绒样品结果。图5为绵羊引物鉴定毛、绒样品结果。图6为山羊引物鉴定毛、绒样品结果。图7为通用引物获得序列比对图。图8为通用引物扩增获得山羊、绵羊及混合样品序列的测序峰图。图9为羊通用引物扩增获得山羊、绵羊及混合样品序列的测序峰图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本实施例中的动物毛干纤维均由北京出入境检验检疫局提供，其成分均为已知，分别为牦牛绒、骆驼绒、细支绵羊毛和山羊绒并依次标注为yak、camel、sheep和goat。此外，在实施过程中，我们人为将绵羊毛与山羊绒按照1:1混合获得混合样品并标注为mix。具体实施步骤如下：1、动物毛干纤维的预处理及DNA提取(1)毛干纤维预处理将动物毛干纤维剪碎成0.2-0.5厘米的长度，使用无水乙醇浸泡30分钟后更换无水乙醇再浸泡30分钟，再使用ddH2O浸泡30分钟后两次更换ddH2O并分别浸泡30分钟，之后将水倒掉并晾干；(2)毛干纤维DNA提取称取处理后的毛干纤维各50mg于2ml离心管中，加入600μL裂解液(10mMTris–HCl，pH8.0，10mMEDTA，100mMNaCl，2％SDS)，加入20μL浓度为1M的二硫代苏糖醇(DTT),再加入20μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，56℃恒温摇床300rpm震荡消化2h至毛干纤维完全消失；加入2μL浓度为1μg/μL的PolyAcarrierRNA作为DNA共沉剂提高毛干纤维中DNA的获得率，之后再使用标准的硅胶吸附法提取并纯化毛干纤维中的DNA。2、引物设计及PCR扩增根据GenBank上公布的牦牛、骆驼、绵羊、山羊线粒体基因序列及其保守序列，分别设计通用引物P1、羊通用引物P2、及针对牦牛(P3)、骆驼(P4)、绵羊(P5)、山羊(P6)四种不同物种来源本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系，其特征在于所述体系包括：毛干纤维预处理方法和DNA提取方法；准确、快速鉴定毛干纤维物种来源的PCR引物对，包括根据多物种线粒体同源基因DNA序列设计的通用引物P1、羊通用引物P2、及针对牦牛(P3)、骆驼(P4)、绵羊(P5)、山羊(P6)四种不同物种来源设计的特异引物；系统判定毛干纤维物种来源的方法，包括结合PCR扩增电泳结果、测序峰图及序列比对系统判定动物毛干纤维的物种来源。
【技术特征摘要】
1.一种区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系，其特征在于所述体系包括：毛干纤维预处理方法和DNA提取方法；准确、快速鉴定毛干纤维物种来源的PCR引物对，包括根据多物种线粒体同源基因DNA序列设计的通用引物P1、羊通用引物P2、及针对牦牛(P3)、骆驼(P4)、绵羊(P5)、山羊(P6)四种不同物种来源设计的特异引物；系统判定毛干纤维物种来源的方法，包括结合PCR扩增电泳结果、测序峰图及序列比对系统判定动物毛干纤维的物种来源。2.根据权利要求1所述的一种区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系，其特征在于：所述的毛干纤维预处理方法为将动物毛干纤维剪碎后使用无水乙醇浸泡30分钟后更换无水乙醇再浸泡30分钟，再使用ddH2O浸泡30分钟后两次更换ddH2O并分别浸泡30分钟，之后将水倒掉并晾干；所述的毛干纤维DNA提取方法为在将处理后的毛干纤维震荡消化至毛干纤维完全消失后，加入2μL浓度为1μg/μL的PolyAcarrierRNA作为DNA共沉淀剂提高毛干纤维中DNA的获得率，再使用硅胶吸附法提取毛干纤维中的DNA。3.根据权利要求1所述的一种区别动物毛干纤维物种来源的分子鉴定体系，其特征在于：准确、快速鉴定毛干纤维物种来源的PCR引物对，包括根据多物种线粒体同源基因DNA序列设计的通用引物P1，其序列为P1F：5’-GTAAATCTCGTGCCAGCCA-3’和P1R：5’-CACCGCCAAGTCCTTTGAG-3’；羊通用引物P2，其序列为P2F：5’-GTCCACTAGATCACGAGCTT-3’和P2R：5’-CAAGATGCAGTTAAGTCCAG-3’；牦牛特异引物P3，其序列为P3F：5’-AGTACATAATTCCTATTGGTAG-3’和P3R：5’-CATTGACTATATGTGCATGCC-3’；骆...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵兴波，向海，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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