用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒技术

本发明专利技术内容涉及在丰富的序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体，例如在过量的正常核酸靶序列中检测低水平体细胞突变和少数等位基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本
技术实现思路
涉及在丰富的序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体，例如在过量的正常核酸靶序列中检测低水平体细胞突变和少数等位基因。【专利说明】用于检测野生型群体中的核酸突变体的方法和试剂盒相关申请的交叉參考本申请要求2010年12月3日提交的美国临时专利申请系列号61/419，639的优先权，将所述临时专利申请系列通过引用整体并入本文。专利
本专利技术涉及在丰富的序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体，例如在过量的正常核酸靶序列中检测低水平体细胞突变和少数等位基因。背景有时期望在丰富的该序列变体中检测DNA序列的稀有变体或多个稀有变体。稀有变体通常是正常基因序列(其有时称为“野生型”序列)的突变。突变，尤其包括稀有突变，通常发现于癌症相关基因、低异质性频率的线粒体基因和来自小亚群的细菌或病毒的基因中。突变等位基因可在DNA序列中仅具有单个改变(例如，点突变)，并且通常它们以极低的丰度存在于含有相应非常丰富的序列的样本中。这些与疾病相关的稀有突变的检测在临床实践中对于疾病诊断和预后起着日益重要的作用。例如，结核病(tuberculosis) (TB)中的点突变可产生抗药性，这使得难以选择恰当的药物来使用以及延长治疗。体细胞突变是癌症的早期检测或对某些肿瘤药物的反应或抗性的预测的有用的生物标志物。KRAS基因的密码子12和13的突变发生在80-90%的胰腺癌和35-50%的结肠癌中。并且EGFR基因或KRAS基因中的突变与对某些肿瘤药物的反应或抗性相关。最近，美国临床肿瘤学会(ASC0)和国家综合癌症网已更新了其指导方针，建议对于患有晩期或转移性结肠癌或直肠癌的患者，将疗法(包括帕尼单抗(panitumumab)或西妥昔单抗(cetuximab))限于具有野生型KRAS的患者。此外，由于难以进入肿瘤区域，因此存在増加的从血液获得肿瘤细胞的需要。极其需要在巨大的野生型等 位基因背景中检测稀有突变的灵敏測定。已开发了许多方法来试图通过实时PCR(聚合酶链式反应)法检测体细胞DNA突变和少数等位基因。这些方法(其中有许多在Milbury，C.A.等，PCR-Based Methods forEnrichment of Minority Alleles and mutations(2009)Clin.Chem.55,第 632-640 页中进行了综述)包括等位基因特异性竞争阻断PCR、阻断PCR、利用锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)的实时基因分型、clamp PCR以及与实时PCR结合的限制性内切酶和与修饰聚合酶结合的等位基因特异性动态PCR。其它方法包括ARMS-PCR、TaqMAMA和FLAG-PCR。利用许多这些方法的方法需要使用修饰碱基、专门的酶或其它专利试剂(proprietary reagent)或方法。此外，大多数方法使用与某些突变序列匹配(即，完全互补)或与相应野生型序列错配的引物，意在仅扩增突变序列，以使终扩增产物都基本上仅为突变型序列。在将引物与突变点杂交的方法中，错配在扩增过程中被消除。PNA或LNA clamp PCR不依赖于突变特异性引物，但PNA或LNA寡核苷酸的生产相较于DNA寡核苷酸的生产非常昂贵。此外，为了确定阴性结果是否表示样本不包含突变体还是是否存在扩增失败，必须运行无PNA或LNA的平行样本。由于昂贵、高检测下限或两者，现有方法已被证明不太令人满意。关于现有选择性扩增測定的重大问题是因Taq DNA聚合酶所犯错误引起的假阳性的发生。減少错误率的一个方法是使用高保真聚合酶例如Pfu或高保真Taq。然而，利用此类酶的PCR扩增效率不太高，并且用于这些高保真聚合酶的PCR条件的最优化十分困难。优先扩增突变等位基因但不需要除Taq DNA聚合酶外的酶并且提供可被测序的扩增产物的PCR扩增方法是C0LD-PCR(參见Milbury等，同上)。C0LD-PCR利用精确控制的PCR变性温度例如86.5°C来优先使可以是包含突变延伸产物的异源双链体(heteroduplexe)的双链体变性，并且从而优先扩增突变序列。该方法的不利方面包括对非常精确的温度控制、变性温度的实验性细调以及突变间的可变性(id)的需要。C0LD-PCR也不能解决因TaqDNA聚合酶所犯错误引起的假阳性的问题。概述本专利技术的方面是用于在丰富的另ー种序列变体中扩增和检测DNA序列的稀有变体的引物依赖性扩增方法，例如利用一对扩增引物以及由常规核苷酸(DNA、RNA和DNA/RNA，仅具有常规碱基置換例如肌苷)组成的廉价的非可延伸的引物阻断发夹型寡核苷酸(阻断剂)在另外的正常序列群体中检测突变序列，特别是稀有突变体，所述ー对扩增引物与稀有和丰富序列二者杂交，从而在扩增过程中不消除突变，其中阻断剂的结合位点包括所讨论的等位变异和与引物之一的结合位点重叠，所述引物称为第一引物并且在非対称方法中是限制引物(limiting primer);其中阻断剂优选与丰富祀序列变体互补并且具有针对丰富序列变体的Tm，所述Tm比其针对稀有序列变体的Tm高至少3°C，优选至少5°C和更优选至少7°C;其中阻断剂的Tm比第一引物的Tm高至少3°C，优选至少5°C的Tm ;其中阻断剂更慢地杂交，优选杂交速度为所述引物的至多1/5 ;并且其中扩增方法包括热循环方案，该方案包括在引物退火之前在阻断剂与丰富的变体杂交但第一引物不进行所述杂交的温度下进行的阻断剂结合步骤，和对于引物杂交足够短但对于阻断剂与稀有序列变体杂交不足够长的引物退火步骤。适当的引物依赖性指数扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)法，特别是非对称PCR法，并且更优选LATE-PCR法。本专利技术的另ー个方面是前述方法中的任何方法，所述方法包括检测，包括但不限于双链扩增产物、单链扩增 产物或两者的均质检测。在某些实施方案中，标记引物阻断发夹型寡核苷酸以便可优选通过荧光检测检测到其与靶序列的杂交。某些优选标记的阻断剂具有3’末端淬灭剂例如Dabcyl或Black Hole淬灭剂。在此类优选的阻断剂中，一些还另外具有5’末端荧光团，即它们是分子信标探针。本专利技术的另ー个方面是抑制丰富野生型的扩增的引物依赖性突变体富集扩增方法，特别是非对称PCR法，该方法包括使用错配的第二引物作为另ー个扩增引物(在非対称PCR法中，过剩引物)，其中首先利用第一引物进行多轮线性扩增，随后利用两种引物进行多轮指数扩增。在非対称PCR的情况下，在多轮指数扩增后进行利用第二(过量)引物进行多轮线性扩增。本专利技术的另ー个方面是包括使用引物阻断发夹型寡核苷酸和使用至少ー种修饰引物(包括错配的第二引物和包括至少ー种加尾引物(tailed primer))以减小聚合酶错误的作用的效果的方法。本专利技术的其它方面包括用于进行上述方法的引物和阻断剂的寡核苷酸组以及试剂盒，所述试剂盒包括此类寡核苷酸组和扩增试剂，任选地还含有一种或多种检测试剂例如DNA结合染料和荧光标记的杂交探针。根据本专利技术的方法是引物依赖性DNA扩增方法，优选为PCR法，其用于在丰富的DNA靶序列的第一变体(所述第一变体与稀有第二变体相异至少ー个碱基变化)存在的情况下优先扩增该DNA靶序列的稀有第二变体，以产生富集在第二变体的扩增子中的扩增产物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾艳伟，JA桑切斯，JE赖斯，LJ万，
申请(专利权)人：布兰代斯大学，
类型：
国别省市：