一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法技术

本发明专利技术属于小分子结合酶位点技术领域，具体涉及了一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6‑二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。本发明专利技术采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；利用小分子与蛋白F262W或蛋白F89W结合，引起蛋白周围环境发生变化，使得荧光发生猝灭，通过判断荧光猝灭的情况实现快速简便的判断小分子是否与果糖1,6‑二磷酸酶的底物位点或变构位点结合，本发明专利技术方法具有特异性好，灵敏度高的优点。

A method for small molecule binding to human liver fructose 1,6 two phosphatase substrate sites or allosteric sites of fast

The invention belongs to the technical field of small molecule binding sites of enzymes, particularly relates to a method for small molecule binding to human liver fructose 1,6 two phosphatase substrate sites or allosteric sites of fast. The invention adopts the amino acid mutagenesis protein sequence two fructose 1,6 phosphatase 262 (substrate site) phenylalanine mutation for tryptophan, denoted as protein F262W; protein sequence two fructose 1,6 phosphatase 89 (allosteric site) phenylalanine mutation for tryptophan, denoted by F89W protein; small molecules with protein F262W or protein F89W protein, caused by the surrounding environment changes, the fluorescence quenching of fluorescence quenching, by judging the situation to achieve quick and easy to judge whether small molecules with fructose 1,6 two phosphatase substrate sites or allosteric binding sites, the method of the invention has good specificity and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法
本专利技术属于小分子结合酶位点
，具体涉及了一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。
技术介绍
二型糖尿病正在成为世界范围性的疾病，预计到2030年，全球将有3.66亿人得糖尿病。糖尿病患者长期存在的高血糖，会损害人体内的各种器官组织，例如眼睛、肾、神经、心脏、还有血管。糖尿病的发病机理主要为胰岛素分泌不足，胰岛素抵抗和肝葡萄糖生成增加。此外，内源性的葡萄糖生成增加是造成糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。内源性的葡萄糖主要来源于肝脏。肝脏内葡萄糖代谢主要为两个途径，一个是糖异生过程，另一个是肝糖原分解。因此通过调节糖异生途径，减少肝脏葡萄糖的生成，成为开发新作用机制抗糖尿病药物的新策略。糖异生作用是将乳酸，丙三醇等三碳前体，在多种酶的催化下转化为葡萄糖的过程。在糖异生过程中，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)催化果糖1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸和一分子磷酸。该催化反应是糖异生过程中的一个控速步骤，抑制果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性，可以减少肝脏葡萄糖的生成，降低血糖水平，达到治疗糖尿病的目的。果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)是一个同源四聚体，由四个结构相同的单位组成。每个单体结构中含有两个结合位点：底物位点和AMP变构位点。目前已经报道了许多化合物对果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)有抑制作用。而清楚明确的知晓小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的结合位点对于小分子的设计改造至关重要。而目前判断小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)结合位点主要有：1.X-Ray晶体体衍射法；2.表面等离子共振；3.同位素标记法。但是这些方法实际操作起来却常常存在较大难度。因此，寻找一种快速简便判断小分子的在果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)结合位点的方法是急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F89W；(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为KSV；同理，将小分子与蛋白F89W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F89W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子与蛋白F89W结合时的荧光猝灭常数，记为K’SV；(3)利用荧光猝灭常数KSV和K’SV进行结果判定：a.若蛋白F262W荧光猝灭且Ksv随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；反之，若蛋白F262W未荧光猝灭或Ksv随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；b.若蛋白F89W荧光猝灭且K’SV随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上；反之，若蛋白F89W未荧光猝灭或K’SV随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上。上述方案中，所述荧光分光光度计检测荧光猝灭过程的测试体系为：0.8mMMg2+，50mMTris-HCl，0.15mg/mL蛋白F262W或蛋白F89W，pH7.4，总体系为1mL。上述方案中，所述荧光分光光度计的设置为：激发波长为280nm，发射波长设为285～400nm，狭缝长度为5，平滑因子为7，电压为710V。上述方案中，利用Stern-Vlomer方程对荧光数据进行处理得到荧光猝灭常数，所述Stern-Vlomer方程为其中F0为不加小分子时波峰最高点的荧光强度，F为加入小分子后波峰最高点的荧光强度，Q为小分子浓度。上述方案中，通过检测301K～310K温度下的荧光猝灭常数用于判定荧光猝灭常数随温度的变化情况。人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列如下所示(见SEQIDNO.1)：ADQAPFDTDVNTLTRFVMEEGRKARGTGELTQLLNSLCTAVKAISSAVRKAGIAHLYGIAGSTNVTGDQVKKLDVLSNDLVMNMLKSSFATCVLVSEEDKHAIIVEPEKRGKYVVCFDPLDGSSNIDCLVSVGTIFGIYRKKSTDEPSEKDALQPGRNLVAAGYALYGSATMLVLAMDCGVNCFMLDPAIGEFILVDKDVKIKKKGKIYSLNEGYAKDFDPAVTEYIQRKKFPPDNSAPYGARYVGSMVADVHRTLVYGGIFLYPANKKSPNGKLRLLYECNPMAYVMEKAGGMATTGKEAVLDVIPTDIHQRAPVILGSPDDVLEFLKVYEKHSAQ本专利技术的有益效果：本专利技术分别在底物位点和变构位点附近引入带有荧光基团的色氨酸，利用小分子与蛋白底物位点或变构位点结合，引起蛋白周围环境发生变化，使得荧光发生猝灭，通过判断荧光猝灭的情况实现快速简便的判断小分子结合果糖1,6-二磷酸酶的底物位点或变构位点，本专利技术方法具有特异性好，灵敏度高的优点。附图说明图1为底物果糖1,6二磷酸(FBP)与果糖1,6-二磷酸酶的底物位点的结合方式。图2为单磷酸腺苷(AMP)与果糖1,6-二磷酸酶的变构位点的结合方式。图3为底物果糖1,6二磷酸(FBP)(0～222μM)在301K时对F262W荧光光谱影响。图4为单磷酸腺苷(AMP)(0～282μM)在301K时对F89W荧光光谱影响。图5为化合物HS36(0～131μM)在301K时对F262W荧光光谱影响。图6为化合物HS36(0～56μM)在301K时对F89W荧光光谱影响。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1蛋白F262W和F89W的制备、表达及纯化采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F262W；采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F89W；经过验证正确的F262W和F89W的重组质粒pPeceiver-B01(金唯智公司提供)被热激活转化到表达菌株BL21(DE3)中，挑取BL21-pPeceiverB01-FBPase重组单菌落接种到20mLLB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，37℃，220rpm过夜培养12–16h。然后将上一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6‑二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为K

【技术特征摘要】
1.一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为KSV；同理，将小分子与蛋白F89W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F89W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子与蛋白F89W结合时的荧光猝灭常数，记为K’SV；(3)利用荧光猝灭常数KSV和K’SV进行结果判定：a.若蛋白F262W荧光猝灭且Ksv随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；反之，若蛋白F262W未荧光猝灭或Ksv随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；b.若蛋白F89W荧光猝灭且K’SV随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-...

【专利技术属性】
技术研发人员：万坚，黄运远，徐榕，韩新亚，肖闪，任彦亮，冯玲玲，饶立，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42