铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法技术

铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，属于斜生栅藻的技术领域，包括斜生栅藻藻种的培养、斜生栅藻藻液的制备，还包括铵盐环境下敌草净对斜生栅藻荧光效应的影响测定：取系列浓度并填加有铵盐溶液的敌草净标准液加入到斜生栅藻藻液中，充分混合并摇匀，控制铵盐溶液、敌草净标准溶液和斜生栅藻藻液的体积比为2：(1‑2)：(1‑2)，同时设置蒸馏水代替敌草净标准溶液的空白对照组，经暗置10‑15min后，用水样荧光检测仪测定斜生栅藻的各叶绿素荧光动力学参数。本发明专利技术方法简单，易操作，可以直观的反应敌草净的生物毒性。

Method for detecting biological toxicity of enemy grass by fluorescence of Scenedesmus obliquus under ammonium salt environment

Detection of semeron toxicity using Scenedesmus fluorescence ammonium salt environment, which belongs to the technical field of Scenedesmus, including culture, Scenedesmus algae Scenedesmus algae liquid preparation, including determination of the enemy grass net influence on s.obliquus fluorescence effect of ammonium salt environment: we took a series of concentration and added with semeron standard solution of ammonium salt solution is added to the Scenedesmus algae liquid, mix and mix, control, ammonium salt solution semeron standard solution and Scenedesmus algae liquid volume ratio is 2: (1 2 (1): 2) at the same time, set the distilled water instead of grass net standard solution enemy blank control group, after 10 unflipped after 15min, the kinetic parameters of chlorophyll fluorescence determination of Scenedesmus with water fluorescence detector. The method of the invention is simple and easy to operate, and can directly reflect the biological toxicity of the enemy grass net.

【技术实现步骤摘要】
铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法
本专利技术属于斜生栅藻的
，涉及用指示藻测定敌草净生物毒性，具体涉及铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法。本专利技术方法快速灵敏。
技术介绍
敌草净英文名称DesMetry，分子式C8H15N5S，影响杂草光合作用，破坏细胞膜，除草效果为叶子的尖部、边缘及叶脉间变黄变枯，最终达到除草目的。敌草净较好适用于棉花、大豆、麦类、花生、向日葵、马铃薯、果树、蔬菜、茶树及水稻田防除稗草、马唐、千金子、野苋菜、蓼、藜、马齿苋、看麦娘、繁缕、车前草等1年生禾本科及阔叶草。我国生产和使用敌草净的历史较短，但已有较大的污染事故发生，应引起足够的重视。敌草净在土壤中不易降解，土壤中残留的敌草净还具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至较深土层，或是随地表径流进入河流、湖泊，对地下水和地表水造成污染。敌草净造成的水污染情况日益严重，对敌草净的检测手段主要集中在HPLC高效液相色谱法和气相色谱法，但这两种方法只能测定敌草净的含量，用浓度表示出来，不能直观反应其在生物体上的毒性表现。现在生物监测方法越来越受到重视，因为其能直接反应污染物对生物体生理特征的影响变化，直接反应污染物的毒性。目前发光细菌法是比较成熟的生物毒性检测方法，敌草净对发光细菌的毒性作用通过发光细菌的发光强度的变化来反应，从而确定敌草净毒性，但是发光细菌法也存在发光细菌不稳定和方法成本高等问题，因此开发一种稳定的、低成本的测定敌草净生物毒性的方法是迫切需要的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，可以全面了解敌草净的毒性效应，而且能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中敌草净暴露的现象和信息，可利用叶绿素荧光分析技术检测敌草净的生物毒性。本专利技术为实现其目的采用的技术方案是：铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，包括斜生栅藻藻种的培养、斜生栅藻藻液的制备，还包括铵盐环境下敌草净对斜生栅藻荧光效应的影响测定：取系列浓度并填加有铵盐溶液的敌草净标准液加入到斜生栅藻藻液中，充分混合并摇匀，控制铵盐溶液、敌草净标准溶液和斜生栅藻藻液的体积比为2：(1-2)：(1-2)，同时设置蒸馏水代替敌草净标准溶液的空白对照组，经暗置10-15min后，用水样荧光检测仪测定斜生栅藻的各叶绿素荧光动力学参数，测定敌草净的生物毒性。斜生栅藻藻种的培养包括，选取斜生栅藻藻种，于无菌条件下将藻种接种至装有液体培养基的锥形瓶中，接种完成，置于恒温光照培养箱中培养至对数期，备用。斜生栅藻藻液的制备包括，将在斜生栅藻藻种的培养过程中得到的对数期的斜生栅藻，通过显微镜镜检得出藻细胞密度，选择细胞密度范围在(1-2)×106ind/·ml-1的对数期斜生栅藻藻液，用于敌草净生物毒性的测定。所述的铵盐溶液的浓度为0.1-0.2mol/L。所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、磷酸铵盐中的一种或两种以上组合。恒温光照培养箱的培养条件是：光照度为2000lx，温度为25±2℃，湿度为75％RH，光暗周期为12h：12h，静置培养，每日摇瓶2-3次，同时更换锥形瓶的位置。所述液体培养基包括以下组分，300mL液体培养基中，KNO310-20mg，(NH4)2SO43-5mg，NH4HCO33-5mg,MgSO4·7H2O3-8mg，CaCl2·2H2O1-5mg，Na2CO31-2mg，FeCl3·6H2O0.1-0.2mg，A5液0.1-0.2mL,延胡索酸5-7mg，酒石酸钠5-7mg，六偏磷酸钠0.1-0.2mg，海藻酸钠0.2-0.5mg，己内酰胺0.1-0.5mg，余量为水。接种时，控制斜生栅藻藻种与液体培养基的体积比为1：(5-6)。系列浓度的敌草净标准液的浓度依次为：10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过叶绿素荧光动力学方法可以快速、灵敏地研究各种逆境对斜生栅藻光合生理的影响，通过各种荧光参数的分析，可以得到光合作用的多种信息。本专利技术应运用于敌草净的快速检测，在添加铵盐的情况下，应用于可短时间内检测出水体中残留的痕量敌草净。本专利技术加铵盐的作用是1.提升检测灵敏度，更全面、直观的了解敌草净的生物毒性；2.可以用于证明铵盐能促进敌草净对斜生栅藻的作用效果。本专利技术斜生栅藻的培养为后续用于测定敌草净生物毒性起到关键作用，斜生栅藻的培养直接影响藻液的悬浮稳定性，而藻液的悬浮稳定性影响敌草净生物毒性的检测，现有的斜生栅藻的培养基多采用BG-11液体培养基，其存在藻体沉降、悬浮于液体中的斜生栅藻分布不均的问题，严重影响敌草净生物毒性的测定，本专利技术液体培养基采用延胡索酸和碳酸钠作为碳源，由于延胡索酸有很强的氧化能力，在酒石酸钠存在条件下，可以对液体培养基的pH值起到缓冲和调节的作用，硫酸铵和碳酸氢铵作为氮源，硫酸铵由于伴随离子是SO42-，随着NH4+的利用，液体培养基中的H+越来越多，会导致液体培养基的pH值降低，影响液体培养基的稳定性，本专利技术通过加入碳酸氢铵解决了该问题，具体是随着HCO32-和NH4+的利用产生OH-，从而调节pH值升高，因此通过硫酸铵和碳酸氢铵的相互配合，既可以提供氮源，同时可以缓冲和调节pH值，稳定液体pH值，pH值波动小或无波动提高了液体培养基的稳定性。上述是通过对液体培养基稳定性的控制，提高后续敌草净生物毒性测定的效果，在液体培养基稳定的条件下，斜生栅藻在液体培养基中的存在状态，对后续敌草净生物毒性的测定有着至关重要的作用，专利技术人为提高斜生栅藻在液体培养基中的悬浮稳定性、降低斜生栅藻的沉降、提高斜生栅藻在液体培养基中的分散均匀度进而进一步提高后续敌草净生物毒性测定的效果，经过长期的创造性研究发现通过向其中加入海藻酸钠、六偏磷酸钠、己内酰胺，严格控制加入比例，结合酒石酸钠的存在，使得斜生栅藻均一、稳定的悬浮在液体培养基中，获得的藻液悬浮稳定、不分层、不下沉，在容器的上层、中间、底层及侧壁处藻含量分散均匀，量取藻液时无需担心有的地方含藻细胞多有的地方含藻细胞少而影响测定效果的问题，量取更方便，效果更直观。而采用其他液体培养基得到的藻液，如采用BG-11液体培养基等，藻液悬浮不稳定，集中在容器的中间位置，上层和侧壁处藻细胞含量与中间位置偏差大，在容器底部有大量的藻沉淀，测量效果体现不明显，效果差。附图说明图1是实施例1敌草净对斜生栅藻PSⅡ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线。图2是实施例1敌草净对斜生栅藻非光化学淬灭(NPQ)影响曲线。图3是实施例1敌草净对斜生栅藻光合电子传递效率(ETR)影响曲线。图4是实施例1敌草净对斜生栅藻光化学淬灭(qP)影响曲线。图5是实施例1敌草净对斜生栅藻PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)影响曲线。图6是实施例2敌草净对斜生栅藻PSⅡ的实际光能转化效率(Y(Ⅱ))影响曲线。图7是实施例2敌草净对斜生栅藻非光化学淬灭(NPQ)影响曲线。图8是实施例2敌草净对斜生栅藻光合电子传递效率(ETR)影响曲线。图9是实施例2敌草净对斜生栅藻光化学淬灭(qP)影响曲线。图10是实施例2敌草净对斜生栅藻PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)影响曲线。图11是实本文档来自技高网...

【技术保护点】
铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，包括斜生栅藻藻种的培养、斜生栅藻藻液的制备，其特征在于，还包括铵盐环境下敌草净对斜生栅藻荧光效应的影响测定：取系列浓度并填加有铵盐溶液的敌草净标准液加入到斜生栅藻藻液中，充分混合并摇匀，控制铵盐溶液、敌草净标准溶液和斜生栅藻藻液的体积比为2：(1‑2)：(1‑2)，同时设置蒸馏水代替敌草净标准溶液的空白对照组，经暗置10‑15min后，用水样荧光检测仪测定斜生栅藻的各叶绿素荧光动力学参数，测定敌草净的生物毒性。

【技术特征摘要】
1.铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，包括斜生栅藻藻种的培养、斜生栅藻藻液的制备，其特征在于，还包括铵盐环境下敌草净对斜生栅藻荧光效应的影响测定：取系列浓度并填加有铵盐溶液的敌草净标准液加入到斜生栅藻藻液中，充分混合并摇匀，控制铵盐溶液、敌草净标准溶液和斜生栅藻藻液的体积比为2：(1-2)：(1-2)，同时设置蒸馏水代替敌草净标准溶液的空白对照组，经暗置10-15min后，用水样荧光检测仪测定斜生栅藻的各叶绿素荧光动力学参数，测定敌草净的生物毒性。2.根据权利要求1所述的铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，其特征在于，斜生栅藻藻种的培养包括，选取斜生栅藻藻种，于无菌条件下将藻种接种至装有液体培养基的锥形瓶中，接种完成，置于恒温光照培养箱中培养至对数期，备用。3.根据权利要求1所述的铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，其特征在于，斜生栅藻藻液的制备包括，将在斜生栅藻藻种的培养过程中得到的对数期的斜生栅藻，通过显微镜镜检得出藻细胞密度，选择细胞密度范围在(1-2)×106ind/·ml-1的对数期斜生栅藻藻液，用于敌草净生物毒性的测定。4.根据权利要求1所述的铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物毒性的方法，其特征在于，所述的铵盐溶液的浓度为0.1-0.2mol/L。5.根据权利要求1所述的铵盐环境下利用斜生栅藻荧光检测敌草净生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔建升，赵德华，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：河北,13