【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一类吡啶-2-炔基羰类化合物及其制备方法和应用。更具体而言，本专利技术涉及通过带有标签或功能分子的啶炔基羰类化合物选择性与蛋白质巯基反应进行交联而得到偶联物及其制备方法和用途。
技术介绍
1、在生命科学研究中，蛋白质修饰有着十分重要的意义，可使蛋白质具有更加复杂的结构和更加多样化的功能。蛋白质修饰可分为天然修饰和人为的化学修饰。最近，蛋白质人为化学修饰越来越受到学者们的关注，人为修饰可使蛋白质获得特定功能，在活性蛋白质组学、靶向药物等研究中得到了广泛使用。
2、目前人为修饰蛋白质有三种方法，一、基因密码子技术，该技术虽然能够精准地修饰蛋白质，但是需要繁琐的生物实验操作，并且存在技术壁垒，适用范围窄；二、融合蛋白技术，即蛋白质标签法，但多肽标签一般在蛋白质末端，功能仅限于改善溶解性，亚细胞定位和亲和吸附，且可能对蛋白质结构与功能有影响；三、化学修饰方法，使用化学试剂选择性地与蛋白质n段、c端和氨基酸残基侧链活性官能团部位直接发生化学反应，该方法较为简单便捷，且是目前应用最为广泛的方法。理想的化学修饰方法需满足以下几点要求：
3、1.与生物溶剂条件相容；
4、2.反应微量高效；
5、3.产物具有一定的稳定性；
6、4.反应具有高度的选择性。
7、半胱氨酸是化学修饰的常用靶点之一，但常用的硫基烷基化反应和迈克尔加成反应修饰都有选择性差，反应产物不稳定，反应速率慢，反应产率低等问题。
8、因此，无论是化学生物学研究还是生物医药
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种反应产率高，反应速率快，反应产物稳定，对含巯基物种选择性好的巯基标记试剂及其合成方法，以及它在蛋白质修饰及偶联化合物中的应用。
2、本专利技术的一个方面，提供了一种吡啶-2-炔基羰类化合物，结构如通式ⅰ所示：
3、
4、其中：
5、x为-ch2-、-o-、-nh-、苯基或苯基衍生物；
6、l为连接在x基团上的-(ch2)n-或-(ch2ch2o)n-，其中n选自0-20中任一整数；
7、r任选自下组中的任一种或多种的组合基团：甲基、氨基、羧基及其活性中间体、用于点击反应的取代基、荧光基团、亚细胞定位基团、具有细胞毒性的药物、小分子抑制剂等。
8、作为一种较佳的实施方式，所述羧基及其活性中间体包括：
9、作为一种较佳的实施方式，所述用于点击反应的取代基包括：-n3,
10、作为一种较佳的实施方式，所述荧光基团选自罗丹明类染料，荧光素类染料，香豆素类染料，多环芳烃类染料，nbd-胺类染料，萘酰亚胺类染料，bodipy类染料或菁类染料荧光基团中的任一种。
11、作为一种较佳的实施方式，所述亚细胞定位基团包括：亚细胞定位肽，
12、作为一种较佳的实施方式，所述具有细胞毒性的药物选自：微管蛋白抑制剂类药物，拓扑异构酶抑制剂类药物，dna结合剂类药物。
13、作为一种较佳的实施方式，所述小分子抑制剂包括：酶抑制剂类、离子通道的阻滞剂类、受体激动剂类、拮抗剂类、反向激动剂类。
14、作为一种较佳的实施方式，所述r基团为用于点击反应的取代基与荧光基团、亚细胞定位基团、具有细胞毒性的药物或小分子抑制剂中的任一种的组合基团，即通过点击反应偶联荧光基团、亚细胞定位基团、具有细胞毒性的药物或小分子抑制剂。
15、本专利技术还提供了上述吡啶-2-炔基羰类化合物的制备方法，以2-乙炔基吡啶和为起始原料，在催化剂和溶剂的存在下进行反应，其中a为卤素，例如i、cl、f、br。
16、作为一种较佳的实施方式，所述催化剂为锂基催化剂，例如正丁基锂。
17、本专利技术还提供了上述吡啶-2-炔基羰类化合物的另一种制备方法，以2-卤代吡啶和为起始原料，在催化剂和溶剂的存在下进行反应。
18、作为一种较佳的实施方式，所述催化剂为铂催化剂和铜催化剂，例如双三苯基膦二氯化铂、碘化亚铜。
19、作为一种较佳的实施方式，所述卤元素包括i、cl、f、br。
20、作为一种较佳的实施方式，上述溶剂选自thf或dmf。
21、本专利技术还提供上述的吡啶-2-炔基羰类化合物用作含还原态巯基的化合物的标记试剂或偶联物，或者用作制备含还原态巯基的化合物的标记试剂或偶联物的应用。
22、作为一种较佳的实施方式，所述含还原态巯基的化合物包括位于细胞内或细胞外的半胱氨酸、多肽、蛋白质、酶、抗体、抗体片段。
23、上述应用涉及到的反应方程式如通式ⅱ所示：
24、
25、其中subs为半胱氨酸、多肽、蛋白质、酶、抗体、抗体片段或其他含有还原态巯基的底物。
26、作为一种较佳的实施方式，所述的x基团为所述的l链为-(ch2)4-。
27、作为一种较佳的实施方式，所述的x基团为-ch2-，所述的l链为-(ch2)3-。
28、作为一种较佳的实施方式，所述吡啶-2-炔基羰类化合物用作标记试剂时，所述r基团为上述的荧光基团或者通过上述的用于点击反应的取代基进一步偶联荧光基团。
29、作为一种较佳的实施方式，所述吡啶-2-炔基羰类化合物用作标记试剂时，所述r基团为通过上述的用于点击反应的取代基进一步缀连亲和标签或包含亲和标签的分子，或者通过其他反应缀连所述亲和标签或包含亲和标签的分子，所述亲和标签包括生物素，脱硫生物素，his-tag，flag，strep-tag ii，ha-tag。
30、作为一种较佳的实施方式，所述吡啶-2-炔基羰类化合物用于细胞荧光成像，其涉及到的反应如通式ⅱ所示。其中subs为细胞内含有还原态巯基的蛋白，r基团选自：-n3，
31、以及通过点击反应或其他反应缀连的罗丹明类染料，荧光素类染料，香豆素类染料，多环芳烃类染料，nbd-胺类染料，萘酰亚胺类染料，bodipy类染料，菁类染料。
32、作为一种较佳的实施方式，所述的x基团为-ch2-，所述的l链为-(ch2)3-，所述的r基团为在将可点击反应的标签标记到细胞蛋白后，使用铜催化的点击反应进一步将罗丹明染料分子连接到细胞蛋白上，从而对蛋白质进行荧光标记。
33、作为一种较佳的实施方式，所述的x基团为-ch2-，所述的l链为-(ch2)3-，所述的r基团为通过点击反应缀连1,8-萘酰亚胺染料分子，直接完成细胞蛋白的荧光标记。
34、作为一种较佳的实施方式，所述吡啶-2-炔基羰类化合物用于蛋白质亚细胞定位，其涉及到的反应如通式ⅱ所示。其中subs为有还原态巯基的蛋白质；r基团选自：通过点击反应或其他反应缀连的亚细胞定位肽，
35、作为一种较佳的实施方式，所述的x基团为-ch2-，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种吡啶-2-炔基羰类化合物，结构如通式Ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述羧基及其活性中间体包括：
3.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述用于点击反应的取代基包括：-N3,
4.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述荧光基团选自罗丹明类染料、荧光素类染料、香豆素类染料、多环芳烃类染料、NBD-胺类染料、萘酰亚胺类染料、BODIPY类染料或菁类染料荧光基团中的任一种。
5.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述亚细胞定位基团包括：亚细胞定位肽，
6.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述具有细胞毒性的药物包括：微管蛋白抑制剂类药物、拓扑异构酶抑制剂类药物、DNA结合剂类药物。
7.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述小分子抑制剂包括：酶抑制剂类、离子通道的阻滞剂类、受体激动剂类、拮抗剂类、反向激动剂类。
8.权利要求1～7任一项所
9.一种权利要求1～7任一项所述的吡啶-2-炔基羰类化合物的应用，其特征在于，用作含还原态巯基的化合物的标记试剂或偶联物，或者用作制备含还原态巯基的化合物的标记试剂或偶联物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含还原态巯基的化合物包括半胱氨酸、多肽、蛋白质、酶、抗体、抗体片段。
...【技术特征摘要】
1.一种吡啶-2-炔基羰类化合物，结构如通式ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述羧基及其活性中间体包括：
3.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述用于点击反应的取代基包括：-n3,
4.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述荧光基团选自罗丹明类染料、荧光素类染料、香豆素类染料、多环芳烃类染料、nbd-胺类染料、萘酰亚胺类染料、bodipy类染料或菁类染料荧光基团中的任一种。
5.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述亚细胞定位基团包括：亚细胞定位肽，
6.根据权利要求1所述的吡啶-2-炔基羰类化合物，其特征在于，所述具有细胞毒性的药物...
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