一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法技术

本发明专利技术涉及一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术将短单链DNA延伸到微米级长单链DNA，加入订书钉后长单链DNA作为脚手架链并进行DNA折纸，具备DNA双链嵌入功能的荧光分子可嵌入到制备DNA纳米折纸结构产物中，不但可以实现实时监控反应过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA纳米技术发展、纳米材料功能化及应用领域，涉及一种通过DNA滚环扩增技术以及DNA折纸术构建的DNA纳米折纸结构，同时利用有双链嵌入特性的荧光染料对此DNA纳米折纸结构进行标记跟踪，不但可以实现实时监控反应过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像等领域。
技术介绍
近年来，恶性肿瘤已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。调查数据显示，在发展中国家，癌症的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位。世界各国投入大量的人力、物力用于肿瘤的预防、诊断和治疗。经研究发现，肿瘤的高致死率主要由于肿瘤细胞具有转移和侵袭能力，约90%肿瘤病人的死亡源于肿瘤的转移，然而早期的治疗干预则会大大提高治疗效果。因此，早期诊断和治疗对于提升肿瘤病人生存率具有至关重要的意义。目前，针对肿瘤生物标记物的检测成为肿瘤早期检测的一大热点。荧光定量分析方法检测是肿瘤生物标记物的检测的常用方法，其检测原理及特异性在肿瘤检测上发挥着重要作用。但目前所用广泛的为荧光定量PCR技术，这一技术在肿瘤标记物的检测方面，仍存在一些问题，如复杂的温度控制及操作步骤、昂贵的试剂仪器、假阳性等，新的荧光定量分析方法亟待出现。DNA折纸术作为一种精确高效的自组装技术，自2006年Rothemund专利技术以来在生物医药、高灵敏度检测、纳米光电子器件、等离子体光子学领域展现出巨大的应用潜力，近年来受到广泛关注。而目前进行DNA折纸时，多利用含7249个碱基的噬菌体单链M13 DNA作为脚手架链，同时需设计几百条几个碱基不等的特定序列单链DNA作为订书钉链，然后再通过特定的折纸程序，进行不同二维纳米结构的组装。在这过程中，实验设计和操作复杂，订购试剂耗资昂贵。因此，本专利技术通过DNA滚环扩增技术使得短链DNA延伸成长单链DNA，后将其作为脚手架链，加入三条订书钉即可通过DNA折纸术制备具有一定宽度的DNA纳米折纸结构，从而通过荧光分子的嵌入，发展一种新的荧光定量分析方法。 
技术实现思路
为克服现有技术的不足，，本专利技术提供一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法。一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术将短单链DNA延伸到微米级长单链DNA，加入订书钉后长单链DNA作为脚手架链并进行DNA折纸，具备DNA双链嵌入功能的荧光分子可嵌入到制备DNA纳米折纸结构产物中，不但可以实现实时监控反应过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像等领域。所述的DNA滚环扩增技术为环模板为一碱基数为96的闭合单链DNA。所述的短单链DNA为碱基数不少于10个，可与环模板互补杂交的一段单链DNA。所述的微米级长单链DNA为重复片段组成的微米级长单链DNA，每个重复片段碱基数为96。所述的订书钉链共三条，每条都能与长单链DNA进行互补杂交。所述的具备DNA双链嵌入功能的荧光分子为嵌入双链之前荧光微弱，而嵌入后则荧光值大大增强，如 SYBRgreen（Synergy Brands green）。所述的DNA纳米折纸结构产物，包含多个双链结构的具有一定宽度，长度可达微米级的DNA纳米结构；所述的生物分子检测领域为DNA、蛋白质、肿瘤标记物小分子的检测。 附图说明：图1为DNA纳米折纸结构与几组对照组分别与荧光分子孵育后的相对荧光强度比较结构；a： 嵌入荧光分子的DNA纳米折纸结构；b：嵌入荧光分子的脚手架链；c：4℃下订书钉链与荧光分子孵育；d：25oC下订书钉链与荧光分子孵育；从图1荧光强度的比较结果，说明包含多双链结构的DNA纳米折纸结构具备更高的荧光值。具体实施方式实施例1：16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)， phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30℃水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（100μM，序列依次为：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’）各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mM Mg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95℃后梯度降温至25℃。10μL产物稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。实施例2：16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)， phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30℃水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（1μM，序列依次为：5’CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’5’CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mM Mg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95℃后梯度降温至25℃。取10μL制备的DNA纳米折纸结构，加入1μL （1000×）SYBRgreen以及90μLmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计（激发波长/发射波长：497nm/520nm ）测试其荧光强度。实施例3：16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术将短单链DNA延伸到微米级长单链DNA，加入订书钉后长单链DNA作为脚手架链并进行DNA折纸，具备DNA双链嵌入功能的荧光分子可嵌入到制备DNA纳米折纸结构产物中，不但可以实现实时监控反应过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像领域。

【技术特征摘要】
1.一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术将短单链DNA延伸到微米级长单链DNA，加入订书钉后长单链DNA作为脚手架链并进行DNA折纸，具备DNA双链嵌入功能的荧光分子可嵌入到制备DNA纳米折纸结构产物中，不但可以实现实时监控反应过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像领域。
2.根据权利要求1所述一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，所述的DNA滚环扩增技术为环模板为一碱基数为96的闭合单链DNA。
3.根据权利要求1所述一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，所述的短单链DNA为碱基数不少于10个，可与环模板互补杂交的一段单链DNA。
4.根据权利要求1所述一种利用DNA纳米折纸结构的荧光定量分析方法，其特征在于，所述的微米级长单链...

【专利技术属性】
技术研发人员：何丹农，颜娟，胡冲娅，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31