用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法，涉及科研和医学草酸检测领域，该试剂包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶，该方法包括以下步骤，收集、纯化待测样品，得到纯化待测液后，分为若干份，配制标定待测液，将每份标定待测液分为两组：测定组和对比组，向测定组加入草酸测定试剂，得到荧光待测组；向对比组加入草酸背景试剂得到对比待测组后测定荧光值，得到草酸的检出限为1.5～3nmol/L。本发明专利技术能够实现高通量检测、在科学研究与临床医学检测中使用，该方法的灵敏度较高，可靠性较好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及科研和医学草酸检测领域，具体涉及一种用于检测尿液和血液中草酸 含量的试剂、试剂盒及方法。
技术介绍
Ox (oxalic acid，草酸）是一种分子式为C2O4H2、分子量为90. 04的二元有机酸。 人体中的草酸包括外源性草酸和内源性草酸，外源性草酸是指通过饮食摄入的草酸，内源 性草酸是指人体肝脏自身代谢产生的草酸，正常人体内的外源性草酸和内源性草酸的含量 基本相同。草酸在人体内为最终产物，无法被进一步代谢降解，只能经过血液循环至泌尿系 统排出体外。 人体内血液和尿液中的草酸含量过高时，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶 体，草酸钙晶体容易在膀胱、肾脏等器官内沉积、形成结石。因此，通过检测人体血液或尿液 中的草酸含量，能够判断患者是否罹患草酸钙形成的结石，进而帮助医生给出合适的治疗 方案。 现有的临床检测草酸的方法包括高效液相色谱法、离子色谱法、辣根过氧化物酶 显色法、酶电极法和酶联免疫法，现有的方法在使用时，存在以下缺陷： (1)离子色谱法使用的DX120色谱系统装配有型号为IonPacASll的分析色谱柱， 离子色谱法测试时，先将待测血浆样品放入超滤离心管，在温度为4°C的条件下离心30min 除去待测样品中的血清蛋白，得上清液，向上清液中加入浓度2mol/L的盐酸进行酸化，该 方法测得健康人血浆中草酸的浓度为I. 47±0. 15umol/L、SD大鼠血浆中草酸的浓度为 9. 88±0. 91umol/L。色谱系统设备的成本较高，检测过程容易受到操作过程和外界环境影 响，得到的结果准确度较低；色谱系统每次只能检测一个样品，不能实现高通量检测，因而 难以在科学研究与临床检测中的使用。 (2)美国Trinity公司研发的草酸测试试剂盒采用HRP(辣根过氧化物酶）显色 法，通过大麦草酸氧化酶将待测样品中的草酸氧化为二氧化碳和过氧化氢，过氧化氢在HRP 作用下与 MBTH(3-methyl-2_benzothiazolinone hydrazone)和 DMAB(3_(dimethylamino) benzoic acid)反应生成化合物indamine dye，由于Indamine dye在590nm处有特征吸收 峰，因此，能够根据Indamine dye反应前后在590nm处吸收峰的变化值计算得到样品中草 酸的含量。 大麦草酸氧化酶的最适pH为3. 2，HRP的最适pH为5. 0?5. 2,两者的最适pH值差 别较大，在实际使用时，难以使得大麦草酸氧化酶和HRP均达到较高的活性，此外，Indamine dye的灵敏度较低，误差较大，只能检测草酸含量较高的样品，难以用于血液样品的检测； 尿液中含有维生素C等物质，容易干扰Indamine dye的灵敏度，因此，需要对待测的尿液进 行多次纯化，步骤比较繁琐，因而难以在临床检测中应用。 (3)方跃等人用丙酮提取法从香蕉皮中提取草酸氧化酶-丙酮粗提物后，与戊二 醛交联并偶合于氧电极，制成香蕉皮_丙酮粉浆草酸组织传感器，用于尿样中草酸测定，该 传感器的工作曲线线性范围为10?500umol/L，检测限为2. 5umol/L，效寿命可维持30天。 该传感器的操作比较复杂、稳定性较差、且有效寿命较短，难以在临床检测中的使用。 (4)上海研谨生物科技有限公司用纯化的大鼠草酸抗体包被微孔板，制成固相抗 体，向包被单抗的微孔中依次加入大鼠草酸，再与HRP标记的草酸抗体结合，形成抗体-抗 原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）显色，TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用酶标仪在450nm波长下 测定吸光度。由于草酸的分子量较小，与单抗作用后容易脱落，形成的抗体_抗原-酶标抗 体复合物经过彻底洗涤后，有效成分的含量较低，该方法检测的灵敏度较低，可靠性较差。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种用于检测尿液和血液中 草酸含量的试剂，其特征在于：包括pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液、浓度为1?50umol/L的 Amplex red荧光染料、浓度为0. 1?2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0. 01?I. OU/ ml的草酸氧化酶。 在上述技术方案的基础上，所述试剂包括PH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液、浓度为 5?20umol/L的Amplex red突光染料、浓度为0. 5?2U/ml的HRP和浓度为0. 1?0. 5U/ ml的草酸氧化酶。 在上述技术方案的基础上，所述试剂包括pH值为5. 4的缓冲溶液、浓度为IOumol/ L的Amplex red荧光染料、浓度为lU/ml的HRP和浓度为0. lU/ml的草酸氧化酶。 一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒,包括若干试剂瓶,每个试剂瓶中 放置有一种或多种试剂，试剂包括pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液、浓度为1?50umol/L的 Amplex red荧光染料、浓度为0. 1?2U/ml的HRP和浓度为0. 01?I. OU/ml的草酸氧化 酶，至少1瓶试剂瓶包括pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为1? 50umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0. 1?2U/ml的HRP ;至少 1瓶试剂瓶包括浓度为〇. 01?I. OU/ml的草酸氧化酶。 在上述技术方案的基础上，所述试剂盒包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一 种或多种试剂，试剂包括pH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液、浓度为5?20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0. 5?2U/ml的HRP和浓度为0. 1?0. 5U/ml的草酸氧化酶；至少1 瓶试剂瓶包括pH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液，至少1瓶试剂瓶包括浓度为5?20umol/L 的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0. 5?2U/ml的HRP ;至少1瓶试剂 瓶包括浓度为〇. 1?〇. 5U/ml的草酸氧化酶。 在上述技术方案的基础上，包括放置有pH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液的试剂瓶， 房子有浓度为5?20umol/L的Amplex red荧光染料的试剂瓶，放置有浓度为0. 5?2U/ml 的HRP的试剂瓶，放置有浓度为0. 1?0. 5U/ml的草酸氧化酶的试剂瓶。 一种用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，包括以下步骤： A、向每升pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液中加入1?50umol Amplex red、100? 2000U HRP和10?1000U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂； 向每升pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液中加入1?50umol Amplex red、和100? 2000U HRP，得到草酸背景试剂； 向每升pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液中加入IOmmol草酸，得到标准草酸试剂； B、收集、纯化待测样品，得到纯化待测液；将纯化待测液均分为若干份，向若干份 纯化待测液中依次加入不同体积的标准草酸试剂，直至纯化待测液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。

【技术特征摘要】
1. 一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：包括pH值为4. 0?7. 5 的缓冲溶液、浓度为1?50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0. 1?2U/ml的辣根过 氧化物酶HRP和浓度为0. 01?1. OU/ml的草酸氧化酶。2. 如权利要求1所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：所述试 剂包括pH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液、浓度为5?20umol/L的Amplex red荧光染料、浓 度为0. 5?2U/ml的HRP和浓度为0. 1?0. 5U/ml的草酸氧化酶。3. 如权利要求2所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：所述试 剂包括pH值为5. 4的缓冲溶液、浓度为10um〇l/L的Amplex red荧光染料、浓度为lU/ml 的HRP和浓度为0. lU/ml的草酸氧化酶。4. 一种基于权利要求1所述的试剂制成的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒， 其特征在于：所述试剂盒包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一种或多种试剂，试剂包 括pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液、浓度为1?50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为 0. 1?2U/ml的HRP和浓度为0. 01?1. OU/ml的草酸氧化酶； 至少1瓶试剂瓶包括pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为1? 50umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0. 1?2U/ml的HRP ;至少 1瓶试剂瓶包括浓度为〇. 01?1. 〇U/ml的草酸氧化酶。5. 如权利要求4所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒，其特征在于：所述 试剂包括pH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液、浓度为5?20umol/L的Amplex red荧光染料、 浓度为〇. 5?2U/ml的HRP和浓度为0. 1?0. 5U/ml的草酸氧化酶，至少1瓶试剂瓶包括 pH值为5. 0?6. 0的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为5?20umol/L的Amplex red 荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为〇. 5?2U/ml的HRP ;至少1瓶试剂瓶包括浓度为 0. 1?0. 5U/ml的草酸氧化酶。6. -种用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，包括以下步骤： 八、向每升口11值为4.0?7.5的缓冲溶液中加入1?50111]1〇1六115)16叉代(1、100?200011 HRP和10?1000U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂； 向每升pH值为4.0?7. 5的缓冲溶液中加入1?50umol Amplex red、和100?2000U HRP，得到草酸背景试剂； 向每升pH值为4. 0?7. 5的缓冲溶液中加入lOmm...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海峰，李娜，姚琦，周健文，李春艳，贺晓霞，
申请(专利权)人：武汉瑞恒达生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42